3D掃描電鏡具有由三極電子槍發出的電子束經柵極靜電聚焦后成為直徑為50mm的電光源。在2-30KV的加速電壓下，經過2-3個電磁透鏡所組成的電子光學系統，電子束會聚成孔徑角較小，束斑為5-10 nm的電子束，并在試樣表面聚焦。 末級透鏡上邊裝有掃描線圈，在它的作用下，電子束在試樣表面掃描。高能電子束與樣品物質相互作用產生二次電子，背反射電子，X射線等信號。這些信號分別被不同的接收器接收，經放大后用來調制熒光屏的亮度。3D掃描電鏡由于經過掃描線圈上的電流與顯像管相應偏轉線圈上的電流同步，因此，試樣表面任意點發射的信號與顯像管熒光屏上相應的亮點一一對應。也就是說，電子束打到試樣上一點時，在熒光屏上就有一亮點與之對應，其亮度與激發后的電子能量成正比。換言之，掃描電鏡是采用逐點成像的圖像分解法進行的。光點成像的順序是從左上方開始到右下方，直到後一行右下方的像元掃描完畢就算完成一幀圖像。這種掃描方式叫做光柵掃描。