ELISPOT全名為Enzyme-linked Immunospot Assay，其技術原理與ELISA相似。其實驗設計是在96微孔培養盤底部披覆PVDF薄膜，用來吸附特殊挑選、且無毒性（不含內毒素）的單克隆抗體。靜脈血PBMC細胞經適當分離處理后，會被分配到微孔盤上，再接受適當的抗原刺激，并將微孔盤放置于溫箱中過夜培養一段時間。一般而言，記憶型T細胞在受抗原刺激數小時后會開始分泌細胞因子，此時局部(在緊靠分泌細胞的周圍)分泌出的細胞因子會被PVDF薄膜上特異抗體捕獲。微孔盤中的細胞被移除并清洗后，被捕獲的細胞因子可進一步使用生物素（Biotin）標記的二次抗體來標志，其后再以結合堿性磷酸酶的生物素，BCIP/NBT 底物孵育后， PVDF 孔板出現“紫色”的斑點表明細胞產生了細胞因子。每個斑點代表每個分泌待測因子的細胞，斑點的多少可以在ELISPOT分析儀上進行自動化技術或在顯微鏡下進行人工計數。統計膜上斑點的數目，除以當初加入孔中的細胞數目，可以算出陽性細胞的頻率。