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原代細(xì)胞切割，取材儀 生物工程

功能特點(diǎn)

原代細(xì)胞切割，取材儀 

適用于切割臍帶、胎盤(pán)、皮膚等軟性組織；

切割均勻，易于爬出和培養(yǎng)；

大幅減少人工剪切時(shí)間和降低工作勞累；

即插即用，采用拋棄型耗材，避免重復(fù)污染；

電動(dòng)型，適合用于在生物安全柜里無(wú)菌操作

可個(gè)性化定制

•上海潤(rùn)予生物醫(yī)療科技有限公司坐落于浦東自由貿(mào)易試驗(yàn)區(qū)張江高科技園區(qū)，是一家集研發(fā)、生產(chǎn)、實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化定制、銷售、服務(wù)及生物樣本庫(kù)解決方案為一體的技術(shù)企業(yè)。公司定位于為自動(dòng)化領(lǐng)域提供具有*自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的系列產(chǎn)品和系統(tǒng)集成服務(wù)，針對(duì)日益上升的科研實(shí)驗(yàn)室、檢驗(yàn)科等領(lǐng)域自動(dòng)化的需求，公司提供實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化整合解決方案，為用戶提高工作效率、降低成本，滿足客戶的各種需求 。

由于細(xì)胞異質(zhì)性的存在，單細(xì)胞層面的分析就變得十分重要。目前對(duì)于單細(xì)胞分析的方法主要還是通過(guò)化學(xué)、生物學(xué)的方法進(jìn)行裂解后，提取內(nèi)容物進(jìn)行分析，然而這種方法往往會(huì)對(duì)樣本造成一些損傷。直接提取活細(xì)胞具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但是操作苦難。如今一種全新使用FluidFM科技的技術(shù)新報(bào)道有望提供一種活細(xì)胞提取新型的簡(jiǎn)易方法。

1.為什么要進(jìn)行活體單細(xì)胞提取

隨著技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于細(xì)胞的研究開(kāi)始向單細(xì)胞領(lǐng)域的分析靠攏。隨著細(xì)胞異質(zhì)性的發(fā)現(xiàn)以來(lái)，人們開(kāi)始更多地認(rèn)識(shí)到即使基因型*相同，但由于基因表達(dá)的不同，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的表型出現(xiàn)差異，從而使得每個(gè)細(xì)胞的功能、組成等各方面也不*相同。而這種差異是在生物界廣泛存在的，即使同源細(xì)胞群中也是存在的。因此對(duì)于單細(xì)胞層面的分子分析，成為了揭示病理特征，細(xì)胞應(yīng)激等方面的重要手段。

在目前的單細(xì)胞分析手段中也面臨著諸多挑戰(zhàn)。目前主要的方法是使用流式細(xì)胞儀或者微流控芯片對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選并隔離單細(xì)胞，然后通過(guò)裂解的方式對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。這種高通量分選的方式雖然快速，但是本身需要將細(xì)胞從原始的培養(yǎng)環(huán)境中取出，這樣始終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部一些生物信息的丟失或損傷。而且由于細(xì)胞破壞方式使用的是化學(xué)或者生物手段裂解，所使用的裂解液也會(huì)對(duì)細(xì)胞之中的一些組分產(chǎn)生破壞。因此單細(xì)胞分析始終面臨著重大的挑戰(zhàn)。

因此，學(xué)者開(kāi)始嘗試從活細(xì)胞中直接提取其成分。目前已經(jīng)有諸多不同的活細(xì)胞提取技術(shù)得到了建立，并且通過(guò)這類的方法所提取分析內(nèi)容的方法所獲得的結(jié)果往往要好于裂解的方式。因此活細(xì)胞提取技術(shù)是一種更加無(wú)損的獲得細(xì)胞內(nèi)組分的方式。

2.使用FluidFM設(shè)備提取細(xì)胞并不會(huì)影響細(xì)胞活力

在本文中，作者對(duì)首先建立了一種使用FluidFM提取細(xì)胞的方法。他們嘗試了各種提取量以確定使用FluidFM能夠?qū)?xì)胞提取的大量。在實(shí)驗(yàn)中他們發(fā)現(xiàn)使用FluidFM抽取4 pL的細(xì)胞質(zhì)并觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)82%的細(xì)胞依然存活，如圖1B所示。但是如果將抽取量加大到4.5 pL則無(wú)細(xì)胞能夠存活。而對(duì)細(xì)胞核而言抽取0.6 pL后，有86%的細(xì)胞依舊存活，如圖1A。而在0.7 pL或以上的體積提取則不可避免的導(dǎo)致細(xì)胞死亡，如圖1B所示。隨后他們對(duì)提取后細(xì)胞的存活狀況進(jìn)行了考察。而后他們繼續(xù)對(duì)提取過(guò)的細(xì)胞進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞的功能并沒(méi)有受到影響。細(xì)胞能夠在提取后約30小時(shí)后正常分裂，如圖1E所示。因此作者認(rèn)為使用FluidFM提取的大量為細(xì)胞核0.6 pL和細(xì)胞質(zhì)4pL。

3.使用FluidFM單細(xì)胞提取物的三種應(yīng)用

3.1透射電鏡負(fù)染色觀測(cè)

對(duì)于細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的觀察，往往對(duì)于揭示細(xì)胞病變有著重要的意義。然而細(xì)胞裂解的傳統(tǒng)手段往往會(huì)產(chǎn)生大量的碎片，因此對(duì)細(xì)胞器的觀察造成了諸多困難。在本篇報(bào)道中，作者通過(guò)使用FluidFM設(shè)備提取細(xì)胞內(nèi)容物，在低溫環(huán)境下轉(zhuǎn)移到透射電鏡的銅網(wǎng)上，然后進(jìn)行負(fù)染色和揮干，之后將片子放到透射電鏡下觀察，并使用傳統(tǒng)裂解方法得到單細(xì)胞溶液同時(shí)鋪設(shè)在銅網(wǎng)上進(jìn)行對(duì)比。通過(guò)觀察他們發(fā)現(xiàn)，使用FluidFM技術(shù)得到的細(xì)胞提取物能夠觀察到大泡狀的結(jié)構(gòu)、小球狀的結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)絲類的結(jié)構(gòu)，如圖2C所示。而相比之下細(xì)胞裂解法得到的結(jié)果卻不盡人意，如圖2D所示。

3.2酶活力的檢測(cè)

酶活力的檢測(cè)對(duì)于探尋細(xì)胞異質(zhì)性有著十分重要的意義。因此作者也對(duì)FluidFM提取的細(xì)胞提取物進(jìn)行了對(duì)比。首先作者通過(guò)β-半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定提取蛋白的完整性。通過(guò)測(cè)定酶解底物產(chǎn)生的熒光素的熒光強(qiáng)度，他們成功觀察到熒光強(qiáng)度隨時(shí)間而增加，說(shuō)明提取物中的蛋白沒(méi)有被破壞，如圖3C、D所示。隨后作者又對(duì)不同細(xì)胞進(jìn)行了不同酶活力的檢驗(yàn)，結(jié)果顯示無(wú)論是LacZ轉(zhuǎn)基因HeLa細(xì)胞上還是在測(cè)定HeLa細(xì)胞的Caspase3酶上均取得了成功，如圖3 E、F所示。

4.3單細(xì)胞級(jí)轉(zhuǎn)錄檢測(cè)

單細(xì)胞層面的基因表達(dá)通常需要反轉(zhuǎn)錄或者PCR擴(kuò)增，之后使用qPCR測(cè)定。而在此之前往往需要將細(xì)胞裂解，而作者他們采用了與傳統(tǒng)方法不同的策略。他們首先創(chuàng)建了使用FluidFM直接從活細(xì)胞中提取大約0.01 pg RNA，并用普通PCR管合成cDNA并進(jìn)行qPCR檢測(cè)，如圖4A所示。由于如此小的提取量是不能直接放到PCR管里面的，所以他們采取的策略是首先將提取液注入1uL水中，然后再轉(zhuǎn)移到PCR管中，進(jìn)行合成和檢測(cè)如圖6B所示。他們檢測(cè)了兩種管家基因beta-actin (ACTB)beta-2-microglobulin (B2M)以及GFP mRNA的表達(dá)量。在21個(gè)樣本中有90%的樣本成功檢測(cè)到至少1中基因的表達(dá)，其中2/3的樣本可以同時(shí)檢測(cè)到三種基因的表達(dá)。而對(duì)細(xì)胞核的檢測(cè)中，也能夠檢測(cè)到至少一種基因的表達(dá)，如圖4C所示。在對(duì)比同一細(xì)胞同時(shí)提取細(xì)胞質(zhì)（1.7 pL）和細(xì)胞核（1.3 pL）中這三種基因的表達(dá)時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)兩者基本相同，如圖4D所示。

總結(jié)

隨著生物研究越發(fā)趨于微觀化，對(duì)于分析單個(gè)細(xì)胞的需求變得越來(lái)越大。但是由于單個(gè)細(xì)胞體積小，所能夠提取出的物質(zhì)相比以前細(xì)胞群落分析來(lái)說(shuō)，難度顯著提高。這不僅對(duì)檢測(cè)儀器的靈敏度有了新的更高的要求，也同時(shí)對(duì)樣本本身的質(zhì)量也提出了更高的指標(biāo)。本篇中使用FluidFM提取活細(xì)胞所取得的樣本質(zhì)量相比于傳統(tǒng)裂解手段有了明顯的提高，從而取得了令人滿意的結(jié)果。另外這種方法控制提取量后，甚至能夠做到不殺死細(xì)胞的情況下完成提取，這使得對(duì)于對(duì)單個(gè)細(xì)胞代謝測(cè)定的追蹤成為了可能。