2-8℃

1.蛋白酶抑制劑未開蓋使用前也可以2-8℃儲存。開蓋使用后-20℃儲存。
2.蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時是固體狀態，從冰箱取出后恢復至室溫或37℃短時間水浴，變成液體狀態后離心至管底部再開蓋。
3.試劑拆封后請盡快使用完！

一年

WB,IP,co-IP,ELISA,EMSA等

動物細胞/組織

1.使用方便，從細胞，組織中提取蛋白不需經過研磨、反復凍融、超聲破碎等前處理。
2.提取過程簡單方便，將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時。
3.含蛋白穩定劑，提取的蛋白穩定。
4.紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。
5.總蛋白提取液含多種有效成分，可以充分釋放胞漿蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可結合釋出的蛋白防止沉淀。
6.蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

WB,IP,co-IP,ELISA,EMSA等

1.離心機
2.振蕩器
3.勻漿機/勻漿器
4.渦旋混勻器
5.移液器
6.冰箱
7.冰盒

1.PBS緩沖液
2.蛋白定量試劑盒

1.離心管
2.吸頭
3.一次性手套

使用注意事項：
? 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。
? 蛋白酶抑制劑在2-8℃時是固體狀態，從冰箱取出后恢復至室溫或37℃短時間水浴，變成液體狀態后離心至管底部再開蓋。
? 實驗過程中的所有試劑須預冷；所有器具須放-20℃冰箱預冷。整個過程須保持樣品處于低溫。
? 蛋白酶抑制劑儲存期間溶液如果出現沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。
? 如果試劑盒不能短時間內用完，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。
? 可以根據自己實驗需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。
? Western實驗內參可以選用Lamin B、TBP、Histon H3。

細胞蛋白提取
1. 提取液制備：
每500 μl冷的蛋白提取液A加入1 μl蛋白酶抑制劑混合物和1 μl磷酸酶抑制劑。
每200 μl冷的蛋白提取液B中加入1 μl蛋白酶抑制劑混合物和1 μl磷酸酶抑制劑，混勻后置冰上備用。
2. 取5-10×106個細胞，在4℃，500×g力條件下離心5分鐘，小心吸取培養基，盡可能吸干，收集細胞。
3. 用冷PBS洗滌細胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。
4. 每20 μl體積細胞沉淀（約20 mg，2×106個細胞）中加入200-300 μl冷的提取液 A，高速渦旋振蕩混勻或吹打混勻，置2-8℃條件振蕩10-30分鐘。
5. 然后在4℃，2000×g條件下離心5分鐘。
6. 將上清吸入另一預冷的干凈離心管，即可得到胞漿蛋白，請置于冰上或-80℃冰箱保存備用。
7. 在沉淀中加入80-200 μl冷的提取液B，高速渦旋振蕩15秒。
8. 置2-8℃條件振蕩30-40分鐘。
9. 在4℃，12000×g條件下離心10分鐘。
10. 將上清吸入另一預冷的干凈離心管，即可得到核蛋白。
11. 將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存備用或直接用于下游實驗。


組織蛋白提取
1. 提取液制備：
每500 μl冷的蛋白提取液A加入1 μl蛋白酶抑制劑混合物和1 μl磷酸酶抑制劑。
每200 μl冷的蛋白提取液B中加入1 μl蛋白酶抑制劑混合物和1 μl磷酸酶抑制劑，混勻后置冰上備用。
2. 取適量組織樣本用手術剪刀盡可能剪碎，每20 mg樣本中加入200-300 μl冷的提取液 A，用組織勻漿器勻漿至無明顯肉眼可見固體。
3. 勻漿液置2-8℃條件振蕩10-30分鐘。
4. 然后在4℃，2000×g力條件下離心5分鐘。
5. 將上清吸入另一預冷的干凈離心管，即可得到胞漿蛋白，請置于冰上或-80℃冰箱保存備用。
6. 在沉淀中加入80-200 μl冷的蛋白提取液B，高速渦旋振蕩15秒。
7. 置2-8℃條件振蕩30-40分鐘，至無明顯沉淀。
8. 在4℃，12000×g條件下離心10分鐘。
9. 將上清吸入另一預冷的干凈離心管，即可得到核蛋白。
10. 將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存備用或直接用于下游實驗。
 

1.核蛋白濃度低？
核蛋白豐度較低，需要足夠細胞數量提取，在條件允許的情況下，盡可能加大細胞量。
注意用蛋白提取液B處理時沒有全部裂解，導致蛋白濃度低。只要適當延長試劑B的處理時間即可。最好在持續振蕩的條件下處理，沒有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻，至無明顯沉淀。
如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白，則需要采用超聲處理。

2.用什么方法定量蛋白？
建議用BCA法。

1.Pingli Li, et al.
Preparation and in vitro immunomodulatory effect of curdlan sulfate
Carbohydrate Polymers 2014 （IF=6.044）

2.Guang Yu, Tonghai Yan et al.
Ser9 phosphorylation causes cytoplasmic detention of I2PP2A/SET in Alzheimer disease
Neurobiology of Aging 2013 （IF=6.189）

3.Wan Li, et al.
Anti-inflammatory effects of Morchella esculenta polysaccharide and its derivatives in fine particulate matter-treated NR8383 cells
International Journal of Biological Macromolecules 2019 （IF=4.784）

4.Mengjuan Wu, et al.
Phosphorylation of SET mediates apoptosis via P53 hyperactivation and NM23-H1 nuclear import
Neurobiology of Aging 2018 （IF=5.117）

5.Xiaoling Ma, et al.
Staphylococcal Panton-Valentine Leukocidin Induces Pro-Inflammatory Cytokine Production and Nuclear Factor-Kappa B Activation in Neutrophils
PloS one 2012 （IF=4.411）

6.Jinchun Qian, et al.
Ophiopogonin D prevents H2O2-induced injury in primary human umbilical vein endothelial cells
Journal of Ethnopharmacology 2010 （IF=3.014）