脾臟（spleen）位于上腹部左后側(cè)，體積較大，長條形，是體內(nèi)最大的淋巴器官，也是血流通路中的過濾器官。脾臟內(nèi)定居著大量的淋巴細胞和其它免疫細胞，是機體發(fā)生特異性免疫應(yīng)答的場所。

1    原理

單個核細胞的體積、形態(tài)和比重與其它細胞不同，在沉降過程中不同比重的細胞會處于不同的分布位置。因此，可利用各種血細胞和單個核細胞比重之間的差異將各種血細胞與單個核細胞分離開來。

2    方法

1）無菌條件下取出脾臟，在培養(yǎng)皿中加入適量的分離液，將脾臟放入細胞篩中，置于分離液中進行研磨（具體方法見示意圖1）。

圖1 脾臟研磨方法示意圖

2）將懸有脾臟細胞的分離液立即轉(zhuǎn)移入無菌離心管中，在上層覆蓋適量的RPMI 1640培養(yǎng)基，且需保持液面分界清晰。

3） 800g，室溫，離心 20min-30min（注：設(shè)置較慢的加速度和減速度，如果有十檔，設(shè)為第三檔）。

4） 離心結(jié)束后，吸棄RPMI 1640培養(yǎng)基，小心吸取脾臟單個核細胞層（即白膜層）并轉(zhuǎn)移至15mL離心管中。離心結(jié)束后，管內(nèi)液面從上至下依次為RPMI 1640培養(yǎng)基層、脾臟單個核細胞層、分離液層和紅細胞層（見圖2）。

圖2 細胞懸液離心前后的分層狀態(tài)圖

5）向離心管中加入10mL 的RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌細胞，250g，室溫離心 10min ，棄上清。重復(fù)該步驟 1~2 次，即可用于后續(xù)試驗。

3    注意事項

1）不同種屬動物單個核細胞的比重有一定差異，請選擇合適的分離液進行脾臟單個核細胞的分離。

2）分離液易揮發(fā)，在脾臟研磨過程中請盡量縮短時間，將研磨時間控制在5min以內(nèi)。

3）研磨過程中請盡量控制研磨力度，保證細胞篩懸空，避免在培養(yǎng)皿底部直接研磨而造成細胞大量死亡。

4）若研磨后細胞懸液呈暗紅色，需將其進行適量稀釋后再進行后續(xù)操作。

5）為保證細胞的活力，整個操作過程請輕柔，避免對細胞造成機械性的損傷。

6）為保持細胞狀態(tài)良好，請盡量縮短整個試驗的周期。

4    脾臟單個核細胞分離試劑盒

IPHASE/匯智和源針對不同種屬動物脾臟單個核細胞分離的特點，開發(fā)了對應(yīng)的單個核細胞分離試劑盒，包括人，猴，犬，大鼠，小鼠，兔，豬等。該試劑盒包含單個核細胞分離液和洗滌液兩個組分，各成分對細胞無毒性，不會影響細胞的原始狀態(tài)；同時，該試劑盒操作簡單便捷，可大大縮短細胞分離時間，分離所得細胞純度高、狀態(tài)好、得率高。

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