在寡核苷酸的應用市場中，診斷行業增長迅速。從核酸檢測相關產品和服務的市場規模來看，PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應）檢測占據核酸檢測的主導地位，并呈現遞增態勢，這主要得益于qPCR（實時熒光定量PCR）這一主流技術的發展。qPCR憑借其靈敏、快速和實時定量的特性，已成為分子診斷、病原體檢測及基因表達分析的關鍵技術之一。

熒光探針法qPCR是臨床檢測中常用的檢測方法，試劑盒中通常包含一對正反向引物及特異性熒光探針。在PCR循環的退火-延伸階段，引物與模板DNA結合，探針定位于目標序列區域，在延伸過程中通過熒光信號實時反映擴增過程。

引物和探針均為固相合成的單鏈寡核苷酸，長度通常為18–30個堿基。根據GB/T 34797—2017標準，可采用質譜法或高效液相色譜法進行純度檢測。本文基于Biozen Oligo色譜柱，構建了一套離子對-反相液相色譜（IP-RPLC）方法，實現多種qPCR引物和探針的高效純度分析。

注：1，2，3代表三種模板基因，F為正向引物，R為反向引物，P為熒光探針

• 色譜柱：Biozen Oligo（2.1 × 100 mm, 1.7 μm, 100 Å）；P/N: 00D-4791-AN

• 流動相：

  A：100 mM 六氟異丙醇+ 15 mM 三乙胺

  B：甲醇

• 流速：0.25 mL/min

• 檢測波長：260 nm

• 柱溫：50 ℃

• 進樣量：1 μL（50 nmol）

圖1. 1-F譜圖（右圖為局部放大）

圖2. 1-R譜圖（右圖為局部放大）

圖3. 1-P譜圖（右圖為局部放大）

圖4. 2-F譜圖（右圖為局部放大）

圖5. 2-R譜圖（右圖為局部放大）

圖6. 2-P譜圖（右圖為局部放大）

圖7. 3-F譜圖（右圖為局部放大）

圖8. 3-R譜圖（右圖為局部放大）

圖9. 3-P譜圖（右圖為局部放大）

引物、探針純度分析結果