很多時候，我們會將這種困難歸因于質譜技術本身。但這項研究給出的答案更值得反思：在真正進入質譜檢測之前，樣品是否能夠在溫和條件下被有效分離，并盡可能保留完整連接狀態，是影響AOC表征質量的關鍵前提。

研究中提到，AOC中存在易受條件影響的連接結構（labile linkage），在傳統反相LC-MS的變性條件下，完整AOC的檢測和解讀會面臨挑戰。也就是說，在很多情況下，問題并不只是“測不到"，而是部分連接狀態或構象信息可能在進入質譜之前受到擾動。

為了解決這個問題，研究采用了native SEC-MS策略，使用Phenomenex Biozen dSEC-2色譜柱在溫和條件下進行分離，使分子可以以更接近天然狀態的形式進入質譜檢測。

當視角從完整分子進一步推進到體系構成層級時，分離的重要性變得更加明顯。AOC不僅包含不同偶聯程度的主產物，還可能包含未偶聯ASO、連接子偶聯的SO和siRNA duplex等構建單元。如果這些組分無法在色譜層面被有效區分，那么后續質譜數據將極難解析。

當分析進一步深入到肽段與偶聯位點層面時，這種“分離決定信息質量"的邏輯再次被強化。AOC表征不僅需要確認序列，還需要明確偶聯位點、翻譯后修飾以及結構異構體，這些信息對色譜分辨率提出了更高要求。

在肽圖分析中，Phenomenex Biozen Peptide XB-C18色譜柱實現了接近序列覆蓋：結果顯示，抗體重鏈覆蓋率達到99.6%，輕鏈達到100%，并成功識別出26個Lys偶聯位點。更值得關注的是，在高質量分離的基礎上，EAD碎裂技術得以充分發揮其優勢，實現了對不穩定PTM、二硫鍵以及同分異構體的高置信解析。