研究說明

本研究旨在評估冷凍對高灌裝深度濃縮制劑凍干的影響。

本研究使用30 mL西林瓶中灌裝15 mL的15% (w/w) 磺丁基醚-7-β-環糊精溶液。在該模型系統的凍干過程中，使用了各種冷凍方法，包括一步冷凍、兩步過冷冷凍、退火、真空誘導冷凍、使用叔丁醇改變冰晶習性、碘化銀誘導冰核，以及其中一些冷凍方法的組合。

這項工作表明，冷凍過程對高灌裝深度濃縮制劑的一次干燥速率和產品質量有顯著影響。退火、真空誘導冷凍以及在配方中添加TBA或冰核劑均加速了后續的冰升華過程。兩步冷凍或添加TBA通過消除餅塊內的垂直異質性改善了產品質量。兩步冷凍結合退火步驟被證明是高灌裝深度產品凍干過程中的冷凍方法。除了是一種有效的冷凍方法外，它也適合于放大生產。另一種方法是在配方中添加一定量的TBA，前提是能夠證明TBA與配方的相互作用或監管方面的問題不存在。本研究中進行的西林瓶尺寸評估表明，雖然使用大直徑西林瓶以減少灌裝深度可以大大縮短單個批次的循環時間，但這將顯著降低大規模凍干機的產品產能。

Q

為什么冷凍是冷凍干燥過程中關鍵的一步？

A

制劑溶液的凍結開始于冰成核，隨后是冰生長。在冷凍階段，大部分水通過玻璃態和/或結晶溶質的基質分離成冰晶。由于用于注射劑型的制劑溶液是經過過濾的，并且相對不含懸浮雜質，因此在冷凍過程中通常會發生過冷，并且通常在低于平衡冰點10至15°C的范圍內觀察到冰核。[通過控制擱板溫度（設定點、升溫速率等）、小瓶中制劑的特性（例如制劑成分、濃度、填充體積/深度）以及玻璃小瓶的內表面特性來確定冰形成過程。在冷凍過程中形成的冰和溶質的微觀結構強烈地影響隨后的一次干燥和二次干燥，并最終影響凍干產品的質量。因此，冷凍是冷凍干燥過程中非常關鍵的一步。大多數冷凍干燥循環開發工作集中在一次干燥階段，即在不降低產品質量的情況下縮短一次干燥時間，在研究冷凍干燥工藝開發中冷凍的影響方面所做的工作相對較少。

環糊精衍生物，特別是2-羥丙基-β-環糊精（HPCD）和磺丁基醚-β-環糊精（SBECD），已越來越多地用作凍干胃腸外制劑賦形劑，因為它們對包括小分子、肽和蛋白質在內的各種分子具有有效的溶解和穩定作用。通常，在這些制劑中需要相對較高的環糊精濃度（10%-20%），并且通常，應用相對高的填充體積以滿足制劑劑量要求。在這項工作中，選擇在30毫升的小瓶中裝入15毫升的15%SBECD溶液進行冷凍干燥，該小瓶具有相對較高的填充深度（約2.8厘米）。在該模型系統的冷凍干燥中使用了不同的冷凍方法，并評價了它們對一次干燥速率和產品質量的影響。討論了這些冷凍方法在凍干產品開發和生產中的實用性。此外，還進行了使用小直徑小瓶（30 mL）與使用大直徑小瓶（50 mL）的比較研究，以評估大型冷凍干燥機中高填充體積產品的通量。

1

冷凍干燥程序

在中試規模的凍干機中進行冷凍干燥。將15mL溶液灌裝到30mL管狀小瓶（約2.8cm填充深度）或50mL模制小瓶（約1.3cm填充深度）。每批次裝載凍干機的兩個擱板，每板約200個30 mL西林瓶或100個50 mL西林瓶。

本研究中所有批次的冷凍干燥循環參數均保持一致，但所采用的冷凍方法和初步干燥期間的擱板溫度除外。表中描述了每批所用的工藝條件。冷凍后，根據電容壓力計的測量結果，將腔室抽真空并控制在90mTorr，同時以0.5℃/min的升溫速率將擱板溫度從-45℃升至-10或0℃（見表1）。通過壓升測試確定冰升華結束時，以0.1℃/min的升溫速率將擱板溫度升高至40℃，并保持6小時。

圖1：單步（慢速）冷凍過程的冷凍行為。A：冰層斷裂并上浮；B. 形成密集濃縮核心

圖2 兩步冷凍過程的冷凍行為。照片A：過冷保溫后快速冷凍；照片B：均勻的冰形成

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凍結行為的視覺觀察

觀察到不同冷凍方法產生的冷凍行為的實質性差異。在一步（緩慢）冷凍過程中，冰核從小瓶的底部邊緣開始，并增長到大約填充深度的三分之一。隨后一些冰斷裂并上升到頂部（圖1A），導致冰從頂部和底部向中部生長。因此，形成了濃縮核心（圖1B）。

在兩步冷凍過程中，由于小瓶中的配方首先被冷卻至-10°C（高于冰核溫度）并達到平衡，因此產品在整個溶液中保持過冷狀態。當擱板溫度快速下降時，發生快速凍結（圖2A），在整個溶液中形成相對均勻的冰（圖2B）。

雖然含5%TBA的配方中的冰核溫度與不含TBA的配方中的冰核溫度沒有顯著差異，但TBA的存在改變了冰的習性。大的針狀冰晶比對照中的晶體形成和生長得更快。

圖3：單步冷凍工藝的SBECD+5%TBA的冷凍行為照片A：冰晶脫離并浮起；照片B：快速自上而下凍結

圖4：真空誘導凍結過程的凍結行為。照片A：填充頂面的冰核；照片B：自上而下的凍結

此外，在五分之四的觀測樣本中，從西林瓶底邊緣成核并生長的冰晶會迅速脫落并上浮至灌裝液頂部（圖3A），引發自上而下的快速凍結過程（圖3B）。這種特殊現象在含叔丁醇制劑的冷凍干燥過程中尚未見報道。雖然大型針狀冰晶加速了一次干燥進程，但自上而下凍結形成的冰結構可能是另一個影響因素。

在真空誘導冷凍實驗中，西林瓶內溶液首先在-10°C環境下進行平衡。當真空度降至600毫托時，液體表面因蒸發降溫引發頂部冰核形成（圖4A），隨即觸發自上而下凍結（圖4B）。隨著冰晶持續生長，形成了相對粗大的垂直冰晶結構。當擱板溫度以超過1°C/分鐘的速率快速降至-45°C并保持時，溶液進一步固化。研究發現，對于高濃度大灌裝深度的制劑，在真空誘導冷凍前將產品維持在-10°C是實現均勻冷凍的關鍵步驟。若按文獻方法在5°C條件下進行預處理，由于蒸發吸熱不足以降低底部溶液溫度，冰層僅能在頂部形成而無法向下延伸。此種情況下，若真空持續時間超過5分鐘，瓶內會發生"噴涌"現象——即未凍結部分溶液沸騰沖開凍結表層。如果降低擱板溫度，會觀察到兩層固化（一層來自真空誘導冷凍，另一層來自擱板冷卻），并且在干燥后觀察到餅狀物在中間斷裂。

圖5：單步冷凍工藝含AgI的SBECD的冷凍行為。照片A：冰從底部向頂部生長；照片B：樹枝狀冰晶的形成

在SBECD配方中加入少量的AgI（冰核劑）大大降低了過冷，冰核溫度提高到約-2°C，如連接在小瓶外表面的熱電偶所示。觀察到冰從底部向頂部生長（圖5A）。在這種情況下，觀察到典型的樹枝狀冰晶（圖5B）。

3

控制批次：確定冰升華終點（一次干燥）

在對照批次（批次I）中，使用了藥品冷凍干燥生產中典型的冷凍工藝：[5]以0.3°C/min的速度將擱板溫度從5°C降至-45°C，并保持3小時，以確保所有小瓶中的產品冷凍和固化。

在一次干燥階段進行了升壓試驗（PRT），但在該批次中PRT的控制功能失效。產品室和冷凝器之間的隔離閥的最大關閉時間設定為20秒，最大壓力上升設定為20毫托，以使壓力上升對冷凍干燥條件的擾動最小，并為測試提供足夠的靈敏度。第一干燥階段持續到所有過程變量指示冰升華完成的點，然后手動推進到第二干燥階段。

這一批的周期時間確實很長，持續了4天多。建立了壓力上升和其他過程變量之間的相關性，包括熱電偶測量的產品溫度、比較壓力（電容壓力計與皮拉尼壓力計）、腔室和冷凝器之間的壓降、N2流速和冷凝器盤管溫度（見圖6）。結果，建立了隔離閥每20秒關閉時間4毫托的壓力上升標準，用于確定冰升華（一次干燥）的終點，并用于自動控制所有其他批次中從一次干燥到二次干燥的循環推進，但批次#VIII除外，其由產品溫度確定。這意味著，如果在測試期間壓力上升小于每分鐘12毫托，則冰升華應該完成。

圖6：對照批次的冷凍干燥工藝概況

4

冷凍工藝對蛋糕外觀的影響

蛋糕的外觀取決于冷凍形成的固體基質結構是否能夠完好保持。若產品溫度過高，該結構在一次干燥和/或二次干燥過程中可能發生變形。

單步冷凍批次（批次I）生產的蛋糕底部略有收縮，中間的紋理不規則。這種不規則性對應于在冷凍階段形成的集中核心。通過兩步冷凍消除了不規則性。添加退火步驟導致更均勻的餅狀外觀。來自真空誘導冷凍批料的餅的頂部比底部具有更多的收縮。含有成核劑AgI的批料產生了條紋狀的餅狀外觀。兩步冷凍結合退火或在配方中添加5%TBA產生最美觀的蛋糕。在50毫升模制小瓶中干燥的濾餅比在30毫升管狀小瓶中干燥的濾餅表現出更大的收縮。

5

凍結過程對垂直均勻性的影響

固體基質結構由冷凍過程決定，該過程包含冰晶成核與晶體生長兩個階段。由于西林瓶內配方溶液中的水分含量是固定的，冰晶成核速率（決定冰核總數）與晶體生長速率之間形成的競爭關系，會導致溶質（輔料和活性分子）在瓶內形成特定分布模式，這種分布最終體現為瓶內均勻性。

在單步冷凍過程中，當晶體生長速率快于冰晶成核速率時，會形成較大的冰晶體。然而這種冷凍方式會導致溶質分布不均。正如冷凍行為觀察所示，這種情況在高灌裝深度的濃縮溶液中會加劇，導致冷凍階段在溶液中心形成濃縮核心。這種不均勻性不僅會大幅增加后續一次干燥的難度，還可能引發終產品的潛在質量問題。

瓶內溶質分布不均會通過改變輔料的穩定效果，對藥物分子（特別是蛋白質分子）造成不利影響，可能誘發緩沖組分結晶，導致瓶內水分分布不均等問題。反之，若冰核形成速率大于冰晶生長速率，樣品中會形成近乎瞬時的冰晶，從而實現溶質在瓶內的均勻分布。

目前針對瓶內不均勻性問題的關注仍顯不足，相關文獻報道也十分有限。對于高濃度、大灌裝深度的制劑冷凍干燥而言，這一問題（特別是垂直均勻性）顯得尤為關鍵。三段重量分析法結果（見圖7）證實：單步冷凍會在干燥產品中形成高度垂直不均勻性，其中部出現高濃度核心，而添加碘化銀可部分改善此現象。通過采用兩步冷凍法（包含過冷保持階段）或添加叔丁醇，可獲得最佳的瓶內均勻性。

圖7：凍干蛋糕的垂直均勻度

6

冷凍過程對干燥產品水分含量的影響

含水量數據匯總于下表。退火處理、兩步冷凍及真空誘導冷凍會使冷凍干燥產品的含水量略有上升，而添加碘化銀的干燥餅塊含水量則增加了一倍。這可能是由于這些冷凍方式增大了冰晶尺寸和/或形成了互聯冰晶結構，從而減少了總表面積，導致二次干燥階段的解吸速率降低。盡管添加叔丁醇改變了冰晶形態，但有趣的是，批次IX的含水量與對照組并無顯著差異。批次IX的實驗結果表明，在此案例中更換更大規格的西林瓶并未對終產品含水量產生影響。

7

冷凍過程對一次干燥時間的影響

由于制劑在冷凍態和干燥固態的微觀結構均由冷凍過程中的冰晶形成決定，冰晶升華速率深受冷凍工藝影響。

在擱板溫度均控制在-10°C的批次中，一次干燥時間按以下順序遞減：單步冷凍（批次I）＞ 兩步冷凍（批次IV）＞ 添加碘化銀（批次X-A）＞ 真空誘導冷凍（批次VII）＞ 兩步冷凍結合-10°C退火（批次V）≈ -10°C退火（批次II）＞ 兩步冷凍結合-2.5°C退火（批次VI）≈ -2.5°C退火（批次III）＞ 真空誘導冷凍結合退火（批次VIII）＞ 添加叔丁醇（批次IX-A）。

雖然冷凍方式改變帶來的傳質阻力提升能加速冰晶升華速率，但在固定擱板溫度和腔室壓力時，這同時會降低產品溫度，從而削弱對一次干燥時間的縮減效果。加速一次干燥速率的主要限制因素在于產品溫度必須始終低于塌陷溫度（Tc）。因此評估不同冷凍方法的優勢時，采用與對照組相同產品溫度和腔室壓力（Tp, Pc）條件下的一次干燥時間節省量作為指標，比使用相同擱板溫度和腔室壓力（Ts, Pc）的條件更具可比性。

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冷凍方法在注射用藥品研發生產中實際應用價值

本研究結果表明，對于高濃度大灌裝深度的制劑冷凍干燥過程，冷凍工藝顯著影響一次干燥速率和產品質量。通過改變冰晶尺寸、結構及冰晶間互聯性（采用退火、真空誘導冷凍或添加冰核劑碘化銀），調整冰晶形態（添加叔丁醇），或改變冰晶分布模式（采用兩步冷凍），均可大幅加速冰晶升華過程。

在注射制劑冷凍干燥中添加叔丁醇已引發制藥領域日益濃厚的興趣。本研究表明，添加叔丁醇不僅能顯著加速高灌裝深度產品的一次干燥速率，同時能有效降低餅塊不均勻性。只要不存在叔丁醇與處方的相互作用及注冊監管問題，該方法可作為優化工藝、提升產品質量的重要策略。

如批次II和III所示，冰晶退火處理能有效降低水蒸氣傳質阻力，進而提升冰晶升華速率。但退火處理無法解決瓶內不均勻性問題。采用過冷保持的兩步冷凍法不僅能制備均勻度良好的餅塊，同時可提高一次干燥速率。若將兩步冷凍與退火工藝聯用，可進一步加速干燥進程，且制得的餅塊兼具美觀外形與高度均勻性。

結論

冷凍工藝對一次干燥速率及產品質量的影響，在高濃度和/或大灌裝深度的制劑中尤為顯著。

退火處理、真空誘導冷凍、添加叔丁醇或冰核劑（碘化銀）均能加速后續冰晶升華過程。兩步冷凍法或添加叔丁醇則可通過消除餅塊垂直方向的不均勻性來提升產品質量。因此，對于大灌裝深度產品的冷凍干燥，兩步冷凍結合退火的聯用方案可作為優選冷凍方案。該方案不僅是高效冷凍方法，更具備良好的工藝放大適用性。

若能證實叔丁醇與處方不存在相互作用且符合監管要求，在處方中添加適量叔丁醇是另一種有效替代方案。采用大直徑西林瓶雖可通過降低灌裝深度顯著縮短生產周期，但會大幅降低工業化凍干機的批次產量。

* 本文譯自論文“A Study of the Impact of Freezing on the Lyophilization of a Concentrated Formulation with a High Fill Depth"如需原文，請聯系萊奧德創。 

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