液相色譜儀開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動(dòng)相，稱為經(jīng)典液相色譜儀，此方法柱效低、時(shí)間長(zhǎng)（常有幾個(gè)小時(shí)）。高效液相色譜儀(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經(jīng)典液相色譜儀的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來(lái)的。它與經(jīng)典液相色譜儀的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱高壓液相色譜儀(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱為高速液相色譜儀(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也稱現(xiàn)代液相色譜。

二、HPLC的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)

HPLC有以下特點(diǎn)：

高壓——壓力可達(dá)150~300 Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。

高速——流速為0.1~10.0 ml/min。

高效——可達(dá)5000塔板每米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。

高靈敏度——紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。

HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：

速度快——通常分析一個(gè)樣品在15~30 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成。

分辨率高——可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到好的分離效果。

靈敏度高——紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá)0.1pg。

柱子可反復(fù)使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。

樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

三、液相色譜儀分類

按兩相的物理狀態(tài)可分為：氣相液相色譜儀(GC)和液相色譜儀(LC)。氣相液相色譜儀適用于分離揮發(fā)性化合物。GC根據(jù)固定相不同又可分為氣固液相色譜儀(GSC)和氣液液相色譜儀(GLC)，其中以GLC應(yīng)用較廣。液相色譜儀適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。LC同樣可分為液固液相色譜儀(LSC)和液相色譜儀(LLC)。此外還有超臨界流體液相色譜儀(SFC)，它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相）為流動(dòng)相（常用CO2），因其擴(kuò)散系數(shù)大，能很快達(dá)到平衡，故分析時(shí)間短，特別適用于手性化合物的拆分。

按原理分為吸附液相色譜儀(AC)、分配液相色譜儀(DC)、離子交換液相色譜儀(IEC)、排阻液相色譜儀(EC，又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透液相色譜儀(GPC）和親和液相色譜儀。（此外還有電泳。）

按操作形式可分為紙液相色譜儀(PC)、薄層液相色譜儀(TLC)、柱液相色譜儀。

四、色譜分離原理

高效液相色譜儀按分離機(jī)制的不同分為液固吸附液相色譜儀、液液分配液相色譜儀（正相與反相）、離子交換液相色譜儀、離子對(duì)液相色譜儀及分子排阻液相色譜儀。

1．液固液相色譜儀使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對(duì)組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個(gè)吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。

2．液相色譜儀使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個(gè)分配平衡過程。

涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動(dòng)相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體表面流失；溫度的變化和不同批號(hào)流動(dòng)相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動(dòng)相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用。現(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。

液相色譜儀按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相液相色譜儀(NPC)和反相液相色譜儀(RPC)。

正相液相色譜儀采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。

反相液相色譜儀一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用較為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右。

隨著柱填料的快速發(fā)展，反相液相色譜儀的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無(wú)機(jī)樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會(huì)使硅膠溶解，太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。有報(bào)告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。

正相液相色譜儀與反相液相色譜儀比較表

從上表可看出，當(dāng)極性為中等時(shí)正相液相色譜儀與反相液相色譜儀沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。

3．離子交換液相色譜儀固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽(yáng)離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測(cè)組分的離子進(jìn)行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離。

緩沖液常用作離子交換色譜的流動(dòng)相。被分離組分在離子交換柱中的保留時(shí)間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外，它還受流動(dòng)相的pH值和離子強(qiáng)度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進(jìn)而影響其與固定相的作用。流動(dòng)相的鹽濃度大，則離子強(qiáng)度高，不利于樣品的解離，導(dǎo)致樣品較快流出。

離子交換液相色譜儀主要用于分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。

4．離子對(duì)液相色譜儀又稱偶離子液相色譜儀，是液相色譜儀的分支。它是根據(jù)被測(cè)組分離子與離子對(duì)試劑離子形成中性的離子對(duì)化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。

分析堿性物質(zhì)常用的離子對(duì)試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、也可與多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對(duì)。

分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。

離子對(duì)液相色譜儀常用ODS柱（即C18），流動(dòng)相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的離子對(duì)試劑，在一定的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行分離。被測(cè)組分保時(shí)間與離子對(duì)性質(zhì)、濃度、流動(dòng)相組成及其pH值、離子強(qiáng)度有關(guān)。

5．排阻液相色譜儀固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動(dòng)相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時(shí)間長(zhǎng)；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動(dòng)相流出。它利用分子篩對(duì)分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。