文中對表達FUCCI2的腸類器官進行了活體成像，并進行了終點固定和免疫熒光評估其細胞類型組成。通過3D配準將最后一個活體成像時間點與染色后的類器官疊加，使用Paneth細胞標記溶菌酶（Lys）和分泌細胞標記Dll1來檢測感興趣的細胞。三重陽性細胞（hCdt1+/Lys+/Dll1+）被反向追蹤以監測Paneth細胞的成熟及其在G0/G1期的細胞周期停滯。成熟Paneth細胞的初始位置預測了類器官隱窩的最終位置。

接下來，比較了隱窩中的hCdt1+/Lys+/Dll1+ Paneth細胞與hCdt1+/Lys?/Dll?細胞（主要是腸干細胞）和類器官絨毛中的細胞（主要是腸細胞）。進一步識別了那些在記錄開始前已經終末分化的腸細胞和Paneth細胞。對于其他細胞，特別是在隱窩中的細胞，確定了它們出現的時間，從而能夠追蹤它們的完整成熟過程，固定時的平均細胞周期長度為21.9小時。評估細胞類型特定的出現時間，得出結論，Paneth細胞比單陽性hCdt1細胞出現得更早，表明特定的細胞周期長度和特定的分化順序。這種對細胞行為和成熟過程的洞見在沒有活體成像和免疫熒光結合整個類器官體積的情況下是無法實現的。

與其他樣本不同，胚狀體是密集結構，因此難以單細胞分辨率成像。文中使用這個模型系統展示顯微鏡獲取單個細胞運動和形態特征的能力。標準胚狀體實驗方案使用Wnt激活劑（Chiron99021）以提高中胚層形成效率。這可能會誘導類似上皮-間質轉化的行為并增加細胞遷移。為了分析胚狀體內的細胞形態，文中生成了嵌合體，其中一部分細胞（約10%）表達膜報告基因（Lck-GFP）。記錄胚狀體在Wnt脈沖前、中和后的動態。此外，將胚狀體嵌入40%的Matrigel中，以防止樣本腔室中的機械旋轉。使用Cellpose對單個細胞進行3D分割，從而計算長軸/短軸比率，顯示細胞伸長在Chir處理期間達到峰值。

后期階段，部分細胞顯示出較長的細胞突起。這一觀察結果提出了細胞運動性在胚狀體發育過程中增加的假設。使用Fiji插件Mastodon，追蹤了Lck-GFP陽性細胞，發現遷移的中位速度在胚狀體發育過程中增加。在Wnt脈沖期間，遷移速度的中位數增加了1.4倍。Wnt激活后成像的胚體展示了最長的軌跡長度。對3D均方位移的評估表明，從90小時開始追蹤的細胞速度增加，并且遷移行為發生了變化。這些發現共同表明，遷移增加，提示Wnt激活增強了細胞運動性并可能在胚體中促進了協調遷移。觀察到的細胞形態變化和運動性增加，部分表明了類似上皮-間質轉化的過程。這一趨勢在嵌入Matrigel中的胚體和懸浮狀態下的胚體之間保持一致。

開放式設計和可定制的樣本支架提供了處理不同類型樣本和實驗設置的靈活性。這種適應性使顯微鏡適用于從類器官研究到發育生物學和癌癥研究的廣泛生物學研究。

開放式多樣本雙視角光片顯微鏡代表了實時成像技術的重大進展。未來的增強可能包括整合自適應光學以進一步提升圖像質量，以及結合激光消融或光遺傳刺激技術以在成像過程中操縱樣本。此外，該系統處理光學透明標本的能力可能擴展其在深層組織成像中的應用。

開放式多樣本雙視角光片顯微鏡的開發和成功應用標志著生物成像領域的關鍵一步。通過在長時間內提供大型多細胞系統的高分辨率三維圖像，這一技術為理解細胞水平上的復雜生物過程開辟了新的途徑。