C-肽ELISA試劑盒

 （德國DRG*：EIA-1293）

1、DRG公司C-肽ELISA試劑盒的臨床應用

1）  接受了胰島素治療的糖尿病患者剩余β-細胞的功能評價。

2）  I型糖尿病患者緩解階段的檢測與監控。

3）  作為I型糖尿病（胰島素依賴性）和II型糖尿病（非胰島素依賴性）鑒別診斷的輔助工具。

4）  胰島素引起的假低血糖癥的診斷。

5）  輔助胰島素瘤的診斷。（胰島素抑制實驗）

6）  用于檢測糖尿病孕婦妊娠成功的預后指數。

7）  肝病患者胰島素分泌的評價。

8）  胰腺切除術的監測。

2、實驗原理

DRG公司C-肽ELISA試劑盒是以競爭原理為基礎。樣品中存在的未知含量的C-肽和已知濃度的C-肽酶聯結物相互競爭結合到小鼠抗C-肽抗血清的結合位點。再與包被在檢測孔上的抗小鼠抗體結合。沒有結合的酶復合物被沖洗下來。加入底物溶液后，樣本中的 C-肽濃度和測得的光密度成反比例。

3、試劑盒組成

1）       微孔反應板，96（孔），包被孔中包被了抗小鼠抗體。

2）       酶聯結物，14ml。即用型，內含C-肽生物素標記物和穩定緩沖液。

3）       酶復合物，14ml，即用型，內含辣根過氧化物酶

4）       標準品系列（0-5），0-16ng/ml（具體濃度請見試劑瓶標簽）。凍干粉，6支，用前加蒸餾水0.75mL。

5）       樣品稀釋液，3ml，即用型。

6）       抗血清：小鼠抗C-肽單克隆抗體，1支，7mL。

7）       底物液，TMB，14ml

8）       終止液，0.5M的H₂SO₄，14ml。

9）       濃縮冼滌液，40倍濃縮，30ml。

4、實驗所需器材但試劑盒不提供

1）  酶標儀

2）  移液器，100；200和1000μl

3）  標準冰箱

4）  吸水紙

5）  去離子水

5、貯存條件

當貯存在2?8℃下，未打開的試劑在有效期內均有效。不要使用過期試劑。半標準品配制好后，所有剩余的標準品必須冷藏于2?8℃的環境下。要更長時間的貯存，可將重新配制好的標準品凍存于-20℃的環境下。C- 肽生物素聯結物、酶復合物、底物溶液、洗滌液和零標準品必須冷藏于2?8℃的環境下。微孔反應板也必須冷藏于2?8℃的環境下。一旦包裝袋拆開，必須將它重新密封好。

6、樣本的采集和準備

血清：靜脈穿刺采集全血，待其凝血，在室溫下離心分離血清。未*凝血前請勿離心，接受了抗凝劑治療的病人樣品可能需要更長的凝血時間。樣本在2~8℃下能存儲24小時，如果需要儲存更長時間則需要在﹣20℃下凍存，并且只能凍融一次

血漿：將全血采集到含有抗凝劑的離心管，采集后立即離心分離。樣本在2~8℃下能存儲24小時，如果需要儲存更長時間則需要在﹣20℃下凍存，并且只能凍融一次

尿液：

1）       24小時內排泄出的尿液總量應收集和混合在單獨的容器中。

2）       記錄下尿液的總體積。

3）       充分混合樣品。離心樣本至澄清，在2~8℃下能儲存36小時；如果要保存更長時間則需要在﹣20℃下凍存，只能凍融一次。

4）       實驗樣本用樣品稀釋液按1：20進行稀釋。

7、試劑準備

標準品：用0.75ml蒸餾水溶解凍干標準品。可以保持不動直至*融化，然后通過輕輕的倒轉充分混勻。重新標配的標準品在2~8℃能保存3天，如果需要保存更長時間則需要放置在﹣20℃下凍存

洗滌液：將30ml的濃縮洗滌液用去離子水1170ml稀釋至1200ml。稀釋后的洗滌液可在室溫下穩定存放2周。

8、實驗步驟

1）       將所需數目的板條置于板架上。

2）       將100μl C—肽標準品，和樣本加到相應的檢測孔中。

3）       各孔中加入50μl抗血清。

4）       各孔中加入100μl酶聯結物。

5）       充分振蕩混勻10秒鐘。

6）       室溫溫育60min。

7）       棄去孔內反應液。

8）       用洗滌液洗板3次（每孔400μl）。末次在吸水紙上拍干反應板。

9）       在每微孔中加入100μl酶復合物。

10）   室溫溫育30分鐘。

11）   棄去孔中的反應液。用洗滌液洗板3次（每孔400μl）。末次在吸水紙拍干反應板。

12）   以相同的時間間隔在每一微孔中加入100μl底物液。

13）   室溫靜置20分鐘。

14）   以相同的時間間隔在每一微孔中加入100μl終止液以終止酶反應。

15）   在加完終止液后10分鐘內在450±10nm處測OD值。

9、結果計算

可以使用任何一個能在450±10nm處測定吸光度值的酶標儀。按下述方法可求得每個樣本血清的C—肽含量值。

1）       在線性或半對數坐標紙上，以每個參考標準品的平均吸光度值（Y）對它們相應的濃度值（X，ng/ml）做一標準曲線。我們建議您用四參數作標準曲線。

2）       利用每個血清樣本的平均吸光度值，通過從標準曲線上讀取相應的C-肽值，如有必要，還乘上初始樣本的稀釋倍數，便可得知它們相應的濃度值。利用DRG公司的ELIZAMAT3000和回歸程序可以讀出數值，并通過使用四參數邏輯功能或立體回歸得到計算機輔助的解釋。

期望值：

血清、尿液中C—肽的正常范圍。

    建議每個實驗室建立起自己的正常人C—肽水平范圍。用DRG公司的C—肽酶聯試劑盒檢測正常男性和女性所得到的正常范圍值羅列如下：

     此外，用6個空腹12個小時后的正常成人做葡萄糖測定。在空腹12小時后，抽取血清。接受測定的人跟著服用50-60克的葡萄糖，在30-45分鐘后再抽取血清樣本進行檢測，結果發現C-肽水平增加了200-600%。

本譯文僅供參考，詳情請以原文為準。

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