苯丙氨酸（PKU）檢測試劑盒說明書

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苯丙氨酸（PKU）檢測試劑盒說明書

德國IBL進(jìn)口原裝，酶標(biāo)儀定量檢測

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中國SFDA注冊：國食藥監(jiān)械（進(jìn)）字2010第3402924號(hào)

【產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)】YZB/GEM 1401-2010

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：苯丙氨酸檢測試劑盒

商品名稱：苯丙氨酸檢測試劑盒

英文名稱：Phenylalanine （PKU） neonatal Screening Assay

【包裝規(guī)格】480人份/盒

【預(yù)期用途】

此試劑盒可用于新生兒血斑中L-苯丙氨酸的體外定量檢測。僅供新生兒苯丙酮尿癥的篩查。

苯丙酮尿癥（PKU）,是一種zui常見的氨基酸代謝遺傳病,它通過常染色體隱性遺傳給子代,在人群中的發(fā)病率為1/2600—1/25000。

發(fā)病的主要原因（90—99%病例）是苯丙氨酸羥化酶的活性降低或缺失。苯丙氨酸羥化酶可以使必需氨基酸苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為酪氨酸，后者是兒茶酚胺、黑色素和甲狀腺激素的前體，由于苯丙氨酸這個(gè)代謝的阻斷，因而通過旁路代謝轉(zhuǎn)化為苯丙酮酸和乙酸鹽，通過腎臟排泄。

該疾病由于在出生后*周,病人代謝抑制就表現(xiàn)出來。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)代謝的改變引起大腦神經(jīng)纖維異常的髓鞘形成對(duì)疾病的發(fā)展起主要作用。苯丙酮尿癥的其它表現(xiàn)有（和附屬物）色素沉著的缺乏。是因?yàn)楹谏匦纬傻奈蓙y，因而引起皮膚病。

在新生兒中對(duì)苯丙酮尿癥的診斷是重要的,因?yàn)榭赏ㄟ^低苯丙氨酸膳食避免腦損害。因而測定血中苯丙氨酸濃度的篩查試驗(yàn)，應(yīng)在出生后3—5天進(jìn)行，假如為陽性，應(yīng)通過檢測染色體特異的突變來進(jìn)行確證試驗(yàn)。

為了檢驗(yàn)苯丙酮尿癥病人發(fā)展了許多篩查試驗(yàn)，zui早的試驗(yàn)是由GUTHRIE 發(fā)明命名的，以枯草桿菌的生長習(xí)性來檢測，枯草桿菌只能在高苯丙氨酸濃度生長。因?yàn)樵摲椒ǖ脑S多缺陷被其它的一些試驗(yàn)替代，這些實(shí)驗(yàn)是利用病人血液中的苯丙氨酸參與的化學(xué)反應(yīng)，利用熒光或顯色底物，進(jìn)行測定。也可以應(yīng)用更可信、更靈敏、更的高壓液相色譜檢測。

【檢驗(yàn)原理】

將血斑紙上的苯丙氨酸用3%的三氯乙酸從濾紙上洗脫。

樣本中的苯丙氨酸在外加苯丙氨酸脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化成苯丙酮酸鹽，此反應(yīng)使存在于反應(yīng)混合物中的輔酶NAD+再生。產(chǎn)生的NADH 使加入的黃色Tetrazalium 鹽發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成紫色物質(zhì)Formazane，在570nm波長測定OD值，OD值與病人樣本中的苯丙氨酸濃度成正比。

【主要組成成分】

1、試劑盒成分

RE80015	標(biāo)簽	成分
1×	ENZ LYO	酶，凍干粉，內(nèi)含苯丙氨酸脫氫酶，輔酶NAD+，緩沖掖，穩(wěn)定劑
1×45ml	ENZDIL	酶稀釋液，即用，內(nèi)含二乙醇胺，緩沖液，0.01%的NaN₃
1×55ml	SUBS	底物，即用，內(nèi)含四唑鹽和檸檬酸鹽。
1×5	CAL A-E	標(biāo)準(zhǔn)品A～E：1;3;6;12;18mg/dl，用2.EWS進(jìn)行校準(zhǔn)。內(nèi)含人血液，Schleicher & Schuell濾紙編號(hào)：903.15血斑紙片。具體濃度請(qǐng)見試劑瓶標(biāo)簽或質(zhì)控單。
1×2	CONTROL 1+2	質(zhì)控品 1+2 質(zhì)控品1：1.8-3.0mg/dl 質(zhì)控品2：4.0-6.0mg/dl 內(nèi)含人血液，Schleicher & Schuell濾紙編號(hào)：903.15血斑紙片。具體濃度及可接受范圍請(qǐng)見試劑瓶標(biāo)簽或質(zhì)控單
1×2ml	DYE CONC	顯色儲(chǔ)存液，51倍濃縮型，內(nèi)含酸性黃23（C.I.19140）

2、實(shí)驗(yàn)需要但試劑盒不提供器材

1）移液器（多道移液器或類似儀器：＜3% CV），體積：25;75;100;600;1000ul。

2）圓底聚苯乙烯試管（12×75mm）

3）試管架

4）試管振蕩器

5）三氯乙酸（3%；w/v），用99.5%的三氯乙酸配得

6）0.5M的NaOH溶液

7）血液采集紙片（建議使用Schleicher & Schuell 903）

8）血斑打孔器，5mm（1/5´´）（例如：Sauer，Hannover，Germany）

9）微孔板（平底）

10）微孔板振蕩器（300-500rpm，振幅：1.5-3.0mm）

11）可在570nm讀數(shù)的酶標(biāo)儀（參比波長：690nm）

12）雙蒸水或去離子水

13）吸水紙，取樣吸頭和計(jì)時(shí)器

【儲(chǔ)存條件及有效期】

試劑盒應(yīng)當(dāng)儲(chǔ)存于2-8℃的環(huán)境下，避免太陽直射，有效期內(nèi)穩(wěn)定。樣品的儲(chǔ)存與穩(wěn)定及試劑的準(zhǔn)備將在相關(guān)單元中說明。有效期見試劑盒標(biāo)簽。

【使用儀器】通用酶標(biāo)儀（配有570nm濾光片）

【樣本要求】

血斑

應(yīng)當(dāng)從嬰兒足跟的中部或內(nèi)測收集足跟血,注意血液采集的常規(guī)注意事項(xiàng).刺破足跟后,*滴血應(yīng)當(dāng)用消毒紗布擦去.將采集卡對(duì)準(zhǔn)血滴,讓足量的血滲入到吸水紙上并充分填滿預(yù)先印好的圓圈。重復(fù)操作，將所需數(shù)目的血斑都制備好。將血斑室溫下涼干3小時(shí)，避免太陽直射。
注意	因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品是用Schleicher & Sshcuell No. 903濾紙確定的，所以濾紙的材料會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們建議您也使用Sshleicher這種紙片。采血時(shí)請(qǐng)勿擠壓穿刺部位，因?yàn)閿D壓會(huì)早成溶血或組織液稀釋血液。不要在采血圈內(nèi)連續(xù)滴血。請(qǐng)勿接觸或涂抹血斑。確保血斑樣品看上去符合實(shí)驗(yàn)要求（例如：血無涂抹，無凝塊，血斑上無指紋）。
注意	樣品應(yīng)當(dāng)在嬰兒出生后第三天到第五天的時(shí)間內(nèi)采集。（出生后72到120小時(shí)內(nèi)）。出生不到72小時(shí)就采集的樣品可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
儲(chǔ)存	2-8℃	避免熱源和太陽直射
穩(wěn)定性	6個(gè)月

【檢驗(yàn)方法】

1、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

（1）酶儲(chǔ)存液的準(zhǔn)備

注意	配置好的酶儲(chǔ)存液在2-8℃可穩(wěn)定存放5天。準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)實(shí)際所需要的酶反應(yīng)液即可。
	在每支凍干的酶試劑瓶內(nèi)加入12ml雙蒸水，蓋好試劑瓶，輕輕混合以使其充分溶解，混合2分鐘，混合時(shí)避免起泡。

（2）酶溶液的準(zhǔn)備

注意

如果您使用了好幾支酶儲(chǔ)存液，我們建議您將各管稀釋液混合并確定混合液的濃度.重新配置好的酶儲(chǔ)存液在18-25℃可穩(wěn)定存放8小時(shí)，儲(chǔ)存于2-8℃的環(huán)境下也不能延長它的有效期

酶溶液的建議配制量：

反應(yīng)板數(shù)	1/3	2/3	1	2	3	4	5
酶儲(chǔ)存液（mL）	0.8	1.6	2.4	4.8	7.2	9.6	12
稀釋液（mL）	2.7	5.3	8.0	16	24	32	40

按照上述表格用稀釋液稀釋酶儲(chǔ)存液，充分混合2min，混合時(shí)避免起泡

（3）有色三氯乙酸（3%）的準(zhǔn)備

用3%三氯乙酸按1：51的比例稀釋顯色儲(chǔ)存液（如：加2ml濃縮型的染色儲(chǔ)存液到100ml3%的三氯乙酸中。配置好的三氯乙酸在18-25℃的環(huán)境下有效期內(nèi)穩(wěn)定。

（4）血斑的洗提

	用打孔器打下標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品血斑紙片（直徑5mm），分別放到相應(yīng)的聚苯乙烯試管中，標(biāo)上標(biāo)簽
	在每一試管中加入100ul 3%三氯乙酸，確保每一紙片都被溶液浸沒。
	振蕩器（300-500rpm，振幅：1.5-3mm）上室溫（18-25℃）溫育30-60分鐘。

2、實(shí)驗(yàn)步驟

1	在微孔板的每一微孔中加入25ul 0.5M的NaOH溶液。
2	將75ul標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和血斑樣品洗提液分別加入到相應(yīng)的微孔中,稍振板以便混合均勻
3	在每一微孔中加入100ul臨時(shí)配置好的酶溶液
4	室溫（18-25℃）下溫育30分鐘
5	在每一微孔中加入100ul底物溶液，振蕩器（300-500rpm，振幅：1.5-3mm）上振蕩3分鐘
6	加入底物后3-5分鐘內(nèi)570nm處讀取OD值

【參考值（參考范圍）】

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

1、結(jié)果計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為Y軸（線形）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為X軸（對(duì)數(shù)）做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線可用線形回歸曲線來做。用計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算時(shí)，用2點(diǎn)線形回歸方程得到的曲線。計(jì)算回歸曲線時(shí)，用每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)值來畫標(biāo)準(zhǔn)曲線（數(shù)值明顯偏離的應(yīng)當(dāng)忽略不要，并使用更接近的數(shù)值來做標(biāo)準(zhǔn)曲線）。樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接讀取。樣品所顯示信號(hào)高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品的必須用參考方法進(jìn)行確認(rèn)。

轉(zhuǎn)換系數(shù)：1mg/dl=60.5μmol/L

典型標(biāo)準(zhǔn)曲線（范例，請(qǐng)勿用其定標(biāo)）

標(biāo)準(zhǔn)品	苯丙氨酸（mg/dl）	平均OD值
A	0.61	0.039
B	2.61	0.074
C	5.81	0.108
D	11.61	0.186
E	17.61	0.283

2、結(jié)果說明

如果血斑樣品中苯丙氨酸的濃度高于3.3mg/dl（=平均值+3倍的標(biāo)準(zhǔn)差）的樣品認(rèn)為是“假陽性”樣品，如果苯丙氨酸的期望值呈正態(tài)分布的話，則3%的受檢人群必須重復(fù)檢測。如果再次檢測的結(jié)果仍高于3.3mg/dl，則應(yīng)當(dāng)再采集新樣品并用證實(shí)實(shí)驗(yàn)分析。關(guān)于新生兒篩查的各種團(tuán)體都建議：TSH的重復(fù)檢測應(yīng)使用不同的臨界值，而且應(yīng)當(dāng)應(yīng)用證實(shí)實(shí)驗(yàn)。鑒于每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都使用不同群體的新生兒樣品，我們強(qiáng)烈建議每個(gè)實(shí)驗(yàn)室確定自己實(shí)驗(yàn)室的正常值范圍，而且其數(shù)值分布應(yīng)當(dāng)與當(dāng)?shù)叵鄳?yīng)社會(huì)團(tuán)體的建議數(shù)值一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果本身僅僅是確定治療結(jié)果的一個(gè)因素，它必須與臨床癥狀及診斷檢測相結(jié)合。

【檢驗(yàn)方法的局限性】

樣品的采集對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有明顯的影響，具體如何采集樣品請(qǐng)見“樣品的采集與儲(chǔ)存”。

篩查檢測中，血斑中苯丙氨酸濃度提高的結(jié)果都被認(rèn)為是“假定陽性”樣品，應(yīng)當(dāng)再次取樣并重新檢測。不能*排除實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性結(jié)果的可能。有苯丙酮尿癥既往病史或臨床癥候的樣品應(yīng)當(dāng)重復(fù)檢測。如果苯丙酮尿癥的病人接受了藥物治療，那么我們不能排除藥物對(duì)苯丙氨酸結(jié)果的直接影響。因此，在上述那些情況下，如果病人有苯丙酮尿癥的既往病史或臨床征候，我們強(qiáng)烈建議您用證實(shí)實(shí)驗(yàn)確定正常的苯丙氨酸值。建議血斑樣品取樣時(shí)使用S&S903濾紙片。如果使用其它的濾紙片，應(yīng)當(dāng)考慮其相應(yīng)的矯正因子。例如，使用2992濾紙片會(huì)使結(jié)果產(chǎn)生20%的不同：標(biāo)準(zhǔn)品（2992）=1.2×（S& S903）+0.181；相關(guān)系數(shù)=0.996；數(shù)量=349

至于交叉反應(yīng)，請(qǐng)見“產(chǎn)品性能指標(biāo)”。

如下血液成分濃度高于下述濃度時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生明顯影響（±15%）：

血紅蛋白	5mg/dl
膽紅素	500mg/dl
甘油三酯	3000mg/dl

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

分析特異性（交叉反應(yīng)）	用有交叉反應(yīng)的典型物質(zhì)檢測，沒發(fā)現(xiàn)有交叉反應(yīng)
靈敏度分析（檢測極限）	1.55mg/dl	靈敏度分析：20%；y=26.33×^-0.6304 R²=0.82
精密度	范圍（mg/dl）	CV（％）
板內(nèi)差異	2.68-9.6	5.8-11.0
板間差異	2.79-9.36	6.4-15.1
線形度	樣品中苯丙氨酸濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)當(dāng)用其它參考方法進(jìn)行證實(shí)。樣本稀釋是不可能的，因?yàn)橄♂層脽o苯丙氨酸血不存在。而無苯丙氨酸的血液浸膏劑做稀釋液可能會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。
重現(xiàn)性	平均值（U/ml）	范圍（%）	加入已知濃度樣品后的重現(xiàn)性%
重現(xiàn)性	101	91-127	加入已知濃度樣品后的重現(xiàn)性%
與其它實(shí)驗(yàn)方法比較	IBL檢測=0.88×其他檢測-0.21		r=0.95；n=98

【注意事項(xiàng)】

1、注意事項(xiàng)與預(yù)防措施

1）試劑僅供體外診斷和專業(yè)人士使用。

2）在檢測開始之前，仔細(xì)和完整的閱讀說明書，使用試劑盒提供的說明書的有效版本，確保所有的程序都清楚。尋求更多信息（比如：臨床背景，檢測操作，自動(dòng)化操作說明，可選擇的軟件，文獻(xiàn)等等），請(qǐng)查看IBL公司主頁。

3）如果試劑盒有破壞的請(qǐng)與IBL公司或供應(yīng)商以書面方式，但自您拿到試劑盒后zui遲不超過一個(gè)星期。在檢測時(shí)請(qǐng)不要使用受損的試劑，以確保自身安全。

4）按照批號(hào)和有效期，不要混合使用不同批號(hào)的試劑，也不要使用過期的試劑。

5）遵守實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化管理規(guī)則和安全指南，穿實(shí)驗(yàn)服，帶橡皮手套，有必要時(shí)請(qǐng)戴護(hù)目鏡。

6）這種試劑盒中含有會(huì)傷害眼睛和皮膚的有害試劑，請(qǐng)閱讀材料來源和標(biāo)簽獲取詳細(xì)信息。產(chǎn)品的材料安全數(shù)據(jù)能夠從IBL公司主頁上下載或直接向IBL公司索取。

7）根據(jù)國家生物有害物質(zhì)及安全條例，所有化學(xué)藥品和準(zhǔn)備或使用過的試劑都應(yīng)當(dāng)做有害物質(zhì)進(jìn)行處理。

8）此試劑中用到的標(biāo)準(zhǔn)品及質(zhì)控品的人血成分經(jīng)乙肝表面抗原，抗-HCV抗體，抗-HIV1+2抗體檢驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為陰性，但是試劑中會(huì)出現(xiàn)此類病毒（HIV/II，HbsAg和HCV）或其他具有感染性的病原體的可能性都不能*被排除。因此，所有的試劑在使用和處理的過程中都應(yīng)當(dāng)作潛在生物有害物質(zhì)進(jìn)行處理。

2、實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)：

1）樣品的不合理處理及實(shí)驗(yàn)操作的任何改動(dòng)都將影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。取樣體積、溫育時(shí)間、預(yù)處理步驟都必須嚴(yán)格按說明進(jìn)行。只能使用標(biāo)準(zhǔn)取樣器和標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備。

2）一旦實(shí)驗(yàn)開始，所有的步驟都必須完整的進(jìn)行下去，不允許中斷。把所有試劑和樣品都拿到18-25℃的實(shí)驗(yàn)室中，在使用前，輕輕搖動(dòng)液體試劑和樣品，試劑混合過程中要避免氣泡。

3）請(qǐng)勿接觸試劑、取樣器、微孔/試管。加試劑和樣本時(shí)，請(qǐng)使用新的取樣吸頭，以避免交叉污染。不用的試劑應(yīng)用蓋子蓋好，以免重復(fù)使用。

4）為了消除潛在的加樣誤差，建議每份樣品都做雙份檢測。

5）用加液記錄表格核對(duì)反應(yīng)板上的排列順序。

6）溫育時(shí)間會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。微孔加樣的順序和時(shí)間都必須一致。建議使用8道移液器向微孔加樣。

【參考文獻(xiàn)】

1. Scriver C.R. and Kaufman S. The hyperphenylalaninemia. In: Scriver C.R., Kaufman S., Eisensmith E., Woo S.L.C., Vogelstein B., and Childs B. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 8th Ed., McGraw Hill, NY, Ch. 27 （2001）.

2. Waisbren S.E., Chang P., Levy H.L., Shifrin H., Allred E., Azen C., Cruz F., Hanley W., Koch R., Malton R., and Rouse B. Neonatal neurological assessment of offspring in maternal phenylketonuria. J. Inherit. Metab. Dis., 21: 39-48 （1998）.

3. Guthrie R. and Susi A. A simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants. Pediatrics, 32: 318-43 （1963）.

4. Randell E.W. and Lehotay D.C. An automated enzymatic method on the Roche COBAS MIRATM S for monitoring phenylalanine in dried blood spots of patients with phenylketonuria. Clinical Chemistry, 29: 133-138（1996）.

5. Madira W.M., Xavier F., Stern J., Wilcox A.H., and Barron J.L. Determination and assessment of the stability of phenylalanine and tyrosine in blood spots by HPLC. Clinical Chemistry, 38: 2162-3 （1992）.

6. Kok W.T.H., Brinkman U.A., and Frei R.W. Rapid determination of phenylalanine and tyrosine in urine and serum by HPLC with electrochemical detection. J. Pharmacological Biochemistry Analytical, 1: 368-72（1983）.

7. McCaman M.W. and Robins E. Fluorimetric method for the determination of phenylalanine in serum. J. Laboratory Clinical Medicine, 59: 885-90 （1962）.

8. Rivero A., Allue J., Grijalba A., Palacios M., and Merlo S.G. Comparison of two different methods for measurement of phenylalanine in dried blood spots. Clin. Chem. Lab., 38: 773-76 （2000）.

9. Lee C. Enzymatic determination of L-phenylalanine in serum. Lab. Med., 24: 301-4 （1993）.

10. Gerasimova N.S., Steklova I.V., and Tuuminen T. Fluorimetric method for phenylalanine assay adapted for phenylketonuria screening. Clinical Chemistry, 35: 2112-5 （1989）.

11. Pearsen KD, Gean-Marton AD, Levy HL, et al. Phenylketonuria: MR imaging of the brain with clinical correlation. Radiology, 1990, 177: 437-440.
12. Brismar J, Aqeel A, Gascon G, et al. Malignant hyper-phenylalaninemia: CT and MR of the brain. AJNR, 1990, 11:135-138.
13. Walter JH, Tyfield LA, Holton JB, et al. Biochemical control, genetic analysis and magnetic resonance imaging in patients with phenylketonuria. Eur J Pediatr, 1993, 152: 822-827.

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