3. NAC2激活SAMT1轉錄

接下來，研究人員開始探索NAC2和MeSA生物合成之間的分子遺傳機制。NAC2作為轉錄因子（擴展數據圖3b），可以定位于細胞核中（擴展數據圖3c）。隨后，研究人員對有和沒有蚜蟲喂食的WT和NAC2植株進行了RNA測序（RNA-seq）和比較轉錄組分析，并鑒定了許多潛在的NAC2調節差異表達基因（擴展數據圖4和補充表1和2），其中SAMT1的結果特別令人感興趣（擴展數據圖4e）。無論這些植物是否受到蚜蟲的侵襲，NAC2植株的SAMT1 RNA水平都低于WT植株（補充表1和2）。SAMT1將SA轉化為MeSA19，研究人員通過定量研究NAC2、HA-NAC2過表達和WT植株葉片組織中的SAMT1轉錄本，以評估NAC2是否通過調節SAMT1的轉錄表達。結果表明，與WT植株相比，NAC2植株的SAMT1 mRNA水平顯著降低，但HA-NAC2過表達植株的SAMT1 mRNA水平升高（擴展數據圖3d，e）。此外，熒光素酶報告基因實驗表明，NAC2增強了SAMT1啟動子控制下的報告基因的轉錄（擴展數據圖3f）。ChIP–qPCR、酵母單雜交和EMSA分析均表明，NAC2與SAMT1啟動子結合，并激活報告基因轉錄（擴展數據圖3g-i）。此外，NAC2的瞬時過表達增加了植物MeSA的產生（擴展數據圖 3j）。這些結果表明，NAC2-SAMT1模塊與植物MeSA生物合成的調控有關。

4. SA激活NAC2-SAMT1模塊引發AD

為了研究NAC2是否通過激活SAMT1轉錄影響接收植株MeSA的產生，研究人員評估了不同處理條件下突變株NAC2、NahG和WT植株中的NAC2和SAMT1的mRNA水平（圖 2f）。蚜蟲侵襲后，WT和NAC2植株的SA水平升高程度相近，然而，細胞MeSA和SAMT表達的增加僅在WT植株中發現（圖2e-g）。在WT接收植株和NAC2接收植株鄰近蚜蟲侵襲植株中也發現了類似的結果（圖 2h-j）。這些結果表明，NAC2是蚜蟲定向誘導或蚜蟲介導的SAMT1表達和揮發性MeSA產生所必需的。此外，外源性SA上調了NAC2和SAMT1在WT植株中的表達，但在NAC2突變株中SAMT1 mRNA的表達水平未顯著改變（圖 2k，l）。與NAC2突變株相比，外源性SA也誘導WT植株的MeSA揮發性和蚜蟲驅避性（圖2m–p），并增加SAMT1-KO植株中NAC2和SAMT1轉錄本的水平（圖 2q；圖2b，c），samt1植株對蚜蟲的吸引力也更強，而且在samt1植株中外源性SA不誘導蚜蟲驅避（圖2r-t）。此外，暴露于蚜蟲侵襲的samt1植株中揮發性MeSA的產生減少（圖3a，b），在進一步的蚜蟲行為學實驗中，研究人員發現與鄰近模擬的WT接收植株相比，鄰近蚜蟲侵襲的WT發射植株的WT接收植株對蚜蟲的驅避性更強，然而，無論何時將這些發射植株暴露于蚜蟲侵襲中，與NAC2或SAMT1發射植株相鄰的WT接收植株在蚜蟲驅避性方面都沒有顯著差異（圖3c-e）。這些結果進一步證實了MeSA作為植物AD中PPC信號的作用。總的來說，結果表明SA可以激活NAC2-SAMT1轉錄進而增加發射和接收植株中揮發性MeSA的產生。

作為一種SA結合蛋白，SABP2也可以與MeSA結合，這對于細胞內MeSA轉化為SA至關重要。因此，SABP2可以作為一種OBP樣受體，感知并將發射植株產生的揮發狀態MeSA轉化為SA以觸發NAC2介導的接收植株中的蚜蟲抗性。為了驗證這一想法，研究人員首先確認SABP2與SA結合（圖3f），通過競爭結合實驗驗證MeSA是否影響SABP2-SA的結合活性（圖3g）。在無MeSA的情況下，SABP2-[3H]SA（50 Ci mmol?1）結合力為100%。然而，在相同的實驗條件下，3nM和15nM的MeSA，SABP2對[3H]SA的結合活性分別降低到約74%和46%（圖3g）。因此，3nM的MeSA足以滿足用于[3H]SA與SABP2的競爭結合實驗，表明MeSA可以以生理濃度與SABP2結合。隨后，研究人員建立了SABP2-KO突變株（sabp2），并測試了sabp2突變株與WT植株的蚜蟲驅避性，用揮發性的MeSA處理，然后進行通氣，揮發性的MeSA處理可增加WT的蚜蟲驅避性和SA生物合成，但對于sabp2突變株并沒有增加（圖3h-j和擴展圖2d）。此外，蚜蟲喂食WT發射植株增加了WT植株的蚜蟲驅避性，但sabp2未增加（圖3k）。此外，外源性的SA對WT和sabp2植株的MeSA揮發性無顯著差異，表明SABP2對MeSA的釋放不是必須的（圖3l，m）。這些結果表明，SABP2確實是一種OBP樣受體，可以感知并將空氣中的MeSA轉化為SA，引起NAC2介導的蚜蟲驅避性。

SAMT1是植物抗病毒免疫所必需的。為了測試SAMT1是否為NAC2介導的植物抗病毒免疫中的一個組成部分。研究人員敲低（KD）samt1植株中的NAC2，使用基于煙草脆裂病毒（TRV）誘導的基因沉默產生nac2/samt1雙突變植株。與NAC2突變株一樣，NAC2-KD植株表現出正常生長，和對CMV和PVY的高易感性（圖1e-j，擴展數據圖5a-e，h-l），表明病毒誘導的基因沉默NAC2-KD與NAC2-KO株有相似性。然而，nac2/samt1和samt1植株表現出相似程度的CMV或PVY易感性（圖 5a-e，h-l）。此外，CMV感染增強了植物細胞內MeSA水平（擴展數據圖5f）。在病毒感染期間，NAC2-KD、samt1和nac2/samt1植株的未侵襲葉片產生相似數量的MeSA，但與WT植株相比，數量較低（擴展數據圖5g）。此外，作者還研究了外源性MeSA或SA在nac2、sabp2、samt1和WT不同植株中，MeSA是否以及如何通過NAC2介導植物抗病毒防御。與WT植株相比，nac2、samt1和sabp2植株對CMV和PVY更易感（圖3n，o）。然而，外源性MeSA可以降低nac2和samt1植株的病毒易感性，但對sabp2植株無效（圖 3n，o），可能是由于WT、nac2和samt1植株中的MeSA轉化為 SA。外噴SA也可以降低nac2、samt1和sabp2植株的病毒易感性（圖3n，o）。這與以下事實一致：SA可以抑制多種病毒對植物的感染，包括CMV、馬鈴薯病毒X和TMV。

綜上所述，MeSA結合蛋白SABP2能夠在結合MeSA時，將細胞間的MeSA轉化成SA。由此實現信號的發起。隨后SA激活NAC2-SAMT1模塊，以此上調內源MeSA水平，促進NAC2依賴性SAMT1的轉錄與翻譯。