猴外周血中性粒細胞分離液試劑盒

本品為帶有乳光或微乳光的滅菌水溶液。主要成分是 Ficoll 400 與泛影酸葡甲胺。適用

于從人或各種動物血液或臟器組織中分離中性粒細胞，在醫療和醫學生物學研究中廣泛應

用。其他人及動物多種比重細胞分離液。注：因不同種屬不同比重分離液的細胞離散系數及

細胞帶電不同，所以用戶在定制分離液時應提供所需分離液的比重、動物的種屬及被分離細

胞的名稱。

猴外周血分離液試劑盒系列產品目錄

1. 適用于人或各種動物血液及臟器組織本系列產品檢索

2. 相關試劑及耗材

3. 注意事項

4. 應用

5. 產品性能指標

6. 貯藏及保存期限

7. 實驗前準備

8. 人或各種動物中性粒細胞分離液使用方法說明及圖例

9. 組織單細胞懸液的制備

10. 紅細胞裂解液使用說明

11. 人或各種動物中性粒細胞分離液試劑盒使用方法說明及圖例

12. 生產企業

13. 參考文獻

1. 適用于人或各種動物血液及 各種動物血液及 各種動物血液及臟器組織本系列產品檢索：：：：

貨號                     品牌              產品名稱          規格         報價

2...相關試劑 2. 相關試劑及耗材

A．．．． 試劑

貨號 名稱 規格 價格

2010C1119 全血及組織稀釋液 500ml 400.00

2010X1118 細胞洗滌液 500ml 200.00

Y2013TBD 組織勻漿液 150ml 150.00

NH4CL2009 紅細胞裂解液 100ml 150.00

B．．．． 耗材

貨號 名稱及規格 生產廠商 價格

3516 6 孔細胞培養板 50 塊/箱 Costar 686.00

3513 12 孔細胞培養板 50 塊/箱 Costar 675.00

3524 24 孔細胞培養板 100 塊/箱 Costar 1287.00

3548 48 孔細胞培養板 100 塊/箱 Costar 1542.00

3599 96 孔細胞培養板 100 塊/箱 Costar 1367.00

430168 25CM 細胞培養瓶(密封蓋) 20 個/包 Corning 113.00

430639 25CM 細胞培養瓶(透氣蓋) 20 個/包 Corning 132.00

430720 75CM 細胞培養瓶(密封蓋) 5 個/包 Corning 56.00

430641 75CM 細胞培養瓶(透氣蓋) 5 個/包 Corning 59.00

430823 150CM 細胞培養瓶(密封蓋) 5 個/包 Corning 102.00

430825 150CM 細胞培養瓶(透氣蓋) 5 個/包 Corning 107.00

431079 175CM 細胞培養瓶(密封蓋) 5 個/包 Corning 133.00

431080 175CM 細胞培養瓶(透氣蓋) 5 個/包 Corning 139.00

431081 225CM 細胞培養瓶(密封蓋) 5 個/包 Corning 167.00

431082 225CM 細胞培養瓶(透氣蓋) 5 個/包 Corning 176.00

430790 15ml 離心管（含泡沫架） 50 支/包 Corning 92.00

430828 50ml 離心管（含泡沫架） 25 支/包 Corning 55.00

430776 250ml 離心管 102 支/箱 Corning 1176.00

4485 1ml 移液管 50 支/包 Costar 55.00

4486 2ml 移液管 50 支/包 Costar 63.00

4487 5ml 移液管 50 支/包 Costar 92.00

430659 2ml 凍存管（可立外旋） 50 支/包 Corning 117.00

430663 5ml 凍存管（可立外旋） 50 支/包 Corning 131.00

GP2012 玻璃吸管 10 支/包 TBD 30.00

GT201210 10ml 玻璃離心管 10 支/包 TBD 90.00

GT201250 50ml 玻璃離心管 5 支/包 TBD 120.00

L147 100/200 目不銹鋼濾網 TBD 150.00

3. .. 注意事項 3. 注意事項

A． 本分離液是敏光型的，在運輸和貯藏過程中應在 18℃-25℃避光保存，啟封后置 4

℃保存避免微生物污染。另外，本品為真空包裝，未啟封前置于 10℃ 以下易出現白色結晶，

影響分離效果。

B． 待分離的血液、組織及細胞要求新鮮，避免冷凍和冷藏。分離液和所分離樣本一

定在20℃水浴箱中復溫20分鐘保證分離液和所分離樣本溫度在20℃±2℃時分離效果，

且所有操作過程一定要在無菌條件下進行。

C． 由于各品牌離心機的性能不同，國內南北地區溫度環境和四季的差異，可能影響

分離效果，用戶可以調節離心轉數，調節離心的時間，摸索*的分離條件（具體分離條件

各實驗室自定）。

D． 使用無靜電反應的離心管，推薦使用未經過堿處理的玻璃離心管。

E． *抗凝劑選擇：EDTA、枸櫞酸、肝素。應注意在血液稀釋過程中應去除抗凝劑

體積。

F． 分離過程中所用其他試劑如：羥乙一基淀粉 550、全血及組織稀釋液、細胞洗滌液及

紅細胞裂解液等以我公司產品為*選擇，本公司相關系列產品無菌、無病毒、無支原體、

低內毒素水平且無細胞毒性，所獲得的細胞可保持完好的生物活性和完整的細胞形態。

4. .. 應 用

適用于從人或各種動物血液或臟器組織中分離中性粒細胞。

5.. . . 產品性能指標

pH 7.0-7.5

滲透壓 280-340mOsmol/kg

內毒素 ≤0.5...EU/ml

無菌 直接接種培養 14 天后培養基澄清 澄明度及不溶性顆粒物 每 50ml 溶液中含 10μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 20 粒以下，，，，

含 25μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 5 粒以下

6.. . . 貯藏及保存期限18℃-25℃避光保存，有效期兩年。啟封后置 4℃保存，有效期一周。

注：：：：若保證無微生物污染，啟封后可置 4℃長期保存。但應注意保存溫度較低時本分離液易出現白色結晶，影響分離效果。

7. .. 實驗前準備 7. 實驗前準備

A． 試劑

中性粒細胞分離液(試劑盒所含試劑)、全血及組織稀釋液、細胞洗滌液、紅細胞裂解液、

組織勻漿液、胎牛血清

B． 器材

玻璃離心管、玻璃滴管

水平轉子離心機、無菌工作臺

8.. . . 各種動物中性粒細胞分離液 各種動物中性粒細胞分離液 各種動物中性粒細胞分離液使用方法說明及圖例 使用方法說明及圖例

A．取 1ml 新鮮抗凝血，與全血及組織稀釋液 1:1 混勻后小心加于 1 份本分離液之液面上；或取 1ml 組織單細胞懸液（具體制備方法詳見 9.組織單細胞懸液的制備）小心加于 1 份本分離液之液面上；

B. 以 500g（約 1800 轉/分）離心 25 分鐘(半徑 15cm 水平轉子)。

此時離心管中由上至下細胞分四層。*層；為血漿層。第二層；為環狀乳白色的單個

核細胞層。第三層；；；；為略帶混濁的分離液層 為略帶混濁的分離液層 為略帶混濁的分離液層（富集一定量的中性粒細胞 富集一定量的中性粒細胞 富集一定量的中性粒細胞）。。。。第四層；為紅細胞層。棄去*層血漿層及第二層細胞，收集第三層分離液層和第四層紅細胞層 收集第三層分離液層和第四層紅細胞層,放入含細胞洗滌液（Cat#：2010X1118）10ml 的試管中，充分混勻后，以 500g 約（1800 轉/分）離心30 分鐘。沉淀經 1 次洗滌后用紅細胞裂解液（Cat#：NH4CL2009）裂解紅細胞，再經 3 次洗滌去除紅細胞內溶物和碎片后取沉淀細胞即為所需中性粒細胞。

注：A.提取率約為 80%。

注

B. 紅細胞裂解過程詳見“10.紅細胞裂解液使用說明”。

血液（人）中各細胞含量參考值 中各細胞含量參考值 中各細胞含量參考值：：：：

男：4.0-5.5×1012/L(400-550 萬個/mm3)

女：3.5-5.0×1012/L(350-500 萬個/mm3 紅細胞 )

新生兒：6.0-7.0×1012/L(600-700 萬個/mm3)

成人：4.0-10.0×109/L(4000-10000 個/mm3) 白細胞 新生兒：15.0-20.0×109/L（15000-20000 個/mm3) 血小板 100-300×109/L（10 萬-30 萬個/mm3) 名稱 占白細胞總數百分比 占白細胞總數百分比 占白細胞總數百分比 嗜中性粒細胞 30%-70% 嗜酸性粒細胞 0.5%-5% 嗜堿性粒細胞 0%-1% 淋巴細胞 20%-40% 白細胞分類計數單核細胞 3%-8%

9.. . . 組織單細胞懸液的制備 組織單細胞懸液的制備

注：：：：A.. .. 本說明只提供機械勻漿制備單細胞懸液的方法 本說明只提供機械勻漿制備單細胞懸液的方法 本說明只提供機械勻漿制備單細胞懸液的方法，，，，酶消化法由于各實驗 酶消化法由于各實驗 酶消化法由于各實驗室選取的消化

酶種類各不相同，，，，請各實驗室自行選擇進行試驗 請各實驗室自行選擇進行試驗 請各實驗室自行選擇進行試驗。。。。

B. .. 全過程及所需試劑要求無菌環境 B. 全過程及所需試劑要求無菌環境 全過程及所需試劑要求無菌環境。。。。

剪碎法：：：：將組織塊放入平皿后，加入少量組織勻漿液及 20%胎牛血清；用眼科剪將組織剪至勻漿狀，加入 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清；用吸管吸取組織勻漿，用 100 目不銹鋼濾網(另購)過濾到試管內；離心沉淀 1500轉/分×3 min，再用細胞洗滌液清洗 3次，每次以 500rpm短時低速離心除去細胞碎片，以 200 目不銹鋼濾網（另購）過濾去細胞團塊。作細胞計數并調整細胞濃度為（2～5）×107個/ml。常溫下放置, 待測細胞的活力。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細胞濃度為 2×108-1×109個/ml 的單細胞懸液備用。 勻漿器法：用眼科剪將組織剪成小塊；放入 70ml 組織研磨器內，加入 2ml 組織勻漿液及 20% 勻漿器法胎牛血清；緩慢轉動研棒，研磨至勻漿；用 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清沖洗研器；收集細胞懸液，經 200 目不銹鋼濾網（另購）過濾；離心沉淀 800rpm×2min ，再用細胞洗滌液洗 3 次，離心沉淀。作細胞計數并調整細胞濃度為（2～5）×107 個/ml。常溫下放置, 待測細胞的活力。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細胞濃度為 2×108-1×109個/ml 的單細胞懸液備用。 細胞計數方法: 細胞計數法是用來計數細胞懸液中細胞數量的一種方法。一般利用計數板（血球計數板）進行。既可用于分離（散）細胞培養接種前計數所制備的細胞懸液中的細胞數量，也可用于對培養物的細胞數量進行計數。不論計數的對象如何，均須制備分散的細胞懸液。

計數與計算過程

1）、在細胞計數板中央放置計數的蓋玻片。

2）、用玻璃虹吸管吸取細胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側的計數板凹蹧處流出懸液，至

蓋玻片被液體充滿為止。

3）、置顯微鏡下計數四角大方格內的細胞總數。對于壓線的細胞只計數在上線和左線者，

對于細胞團按單個細胞計數。

4）、按下式計數細胞懸液的密度：

細胞密度＝（4 個大格細胞總數/4）×104個/ml×稀釋倍數

公式中乘以 104因為計數板中每一個大格的體積為：1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1m（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3細胞計數要點： 細胞計數要點：：：

A． 進行細胞計數時，要求懸液中細胞數目不低于 104個/ml，如果細胞數目很少要進行離

心再懸浮于少量培養液中；顯微鏡下計數時，遇到 2 個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算。如果細胞團>10％，說明細胞分散不充分; 或細胞數<200 個/10mm2或>500 個/10 mm2 時，說明稀釋不當，需重新制備細胞懸液。

B． 要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數準確性。

C． 取樣計數前，應充分混勻細胞懸液，尤其是多次取樣計數時更要注意每次取樣都要混

勻，以求計數準確；

D． 數細胞的原則是只數完整的細胞，若細胞聚集成團時，只按照一個細胞計算。如果細

胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計左線，不計右線。

E． 操作時，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數。

初學者易犯的錯誤： 初學者易犯的錯誤：：：

A． 計數前未將待測懸液吹打均勻。

B． 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現氣泡。

C． 滴入懸液時的量太多，至使細胞懸液流入旁邊的槽中。

10.. . . 紅細胞裂解液使用說明 紅細胞裂解液使用說明

本裂解液有別于市場 本裂解液有別于市場上銷售的其它紅細胞裂解液，，，，其配方經過本公司優化在裂解紅細 其配方經過本公司優化在裂解紅細胞的同時不損傷并在一定程度上保護淋巴細胞(lymphocyte) 胞的同時不損傷并在一定程度上保護淋巴細胞(lymphocyte) (lymphocyte)或其它有細胞核的細胞 或其它有細胞核的細胞 或其它有細胞核的細胞，，，，所獲得的細胞可保持完好的生物活性和完整的細胞形態 得的細胞可保持完好的生物活性和完整的細胞形態。。。。另外，，，，本裂解液中無DNA及RNA酶，，，，配合細胞分離液使用所提細胞可廣泛用于細胞培養及分子生物學實驗， 合細胞分離液使用所提細胞可廣泛用于細胞培養及分子生物學實驗，，，請廣大用戶從優選擇 請廣大用戶從優選擇 請廣大用戶從優選擇。。。。 紅細胞裂解液(Red Blood Cell Lysis Buffer)，也稱ACK Lysis Buffer，是一種用于

從人或鼠等的血液或組織細胞樣品中裂解并去除無細胞核紅細胞的溶液。 本裂解液不適用于有細胞核紅細胞的裂解，例如鳥或禽類的紅細胞。本裂解液經過無菌處理，處理過的血液或組織細胞樣品可以用于后續的原代培養、細胞融合以及核酸或蛋白的

提取及各種常規的分析和檢測。

使用說明：：：：

A. .. 對于組織細胞樣品 A. 對于組織細胞樣品 對于組織細胞樣品：：：：

a. 新鮮組織經過膠原酶或胰酶等消化處理，通過適當方法分散成細胞懸液，離心棄上清。

b. 加入3-5倍細胞體積的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。例如細胞沉淀的體

積為1ml，則加入3-5ml的紅細胞裂解液。本步驟在室溫或4度操作均可。

c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

d. 如果發現紅細胞裂解不*，可以重復上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細胞不

會影響后續的一些檢測。

e. 洗滌1-2次：加入適量PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養液，重懸沉淀，400-500g離心

2-3分鐘，棄上清。可再重復1次，共洗滌1-2次。洗滌液的用量通常應至少為細胞沉淀

體積的5倍。4℃離心效果更佳。

f. 根據實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數等后續實驗。

B. .. 對于組織細胞樣品無需洗滌的快速操作步驟 B. 對于組織細胞樣品無需洗滌的快速操作步驟 對于組織細胞樣品無需洗滌的快速操作步驟：：：：

a. 新鮮組織經過膠原酶或胰酶等消化處理，通過適當方法分散成細胞懸液，離心棄上清。

b. 對于0.2ml細胞沉淀加入1ml紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。本步驟在室溫 或4度操作均可。

c. 加入15-20ml PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養液，混勻。

d. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

e. 如果發現紅細胞裂解不*，可以重復上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細胞不 會影響后續的一些檢測。

f. 根據實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數等后續實驗。

注：：：：對于常規步驟，多一步洗滌過程中的離心，但可以節省洗滌液的用量，并且洗滌效果也 更好一些，同時不需要大體積的離心管?？焖俨襟E少了一次離心，但洗滌效果略差一些，同 時需要大體積的離心管。

C. .. 對于血液樣品 C. 對于血液樣品：：：：

a. 取新鮮抗凝血，400-500g離心5分鐘，離心棄上清。

b. 加入6-10倍細胞體積的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。例如細胞沉淀的體 積為1ml，則加入6-10ml的紅細胞裂解液。本步驟在室溫或4度操作均可。注意：對于鼠 的血液，裂解1-2分鐘已經足夠，對于人的外周血，宜延長裂解時間至4-5分鐘，并且裂解過程中宜適當偶爾搖動以促進紅細胞裂解。

c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

d. 如果發現紅細胞裂解不*，可以重復上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細胞不 會影響后續的一些檢測。

e. 洗滌1-2次：加入適量PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養液，重懸沉淀，400-500g離心 2-3分鐘，棄上清?？稍僦貜?/span>1次，共洗滌1-2次。洗滌液的用量通常應至少為細胞沉淀

體積的5倍。4℃離心效果更佳。

f. 根據實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數等后續實驗。

注：：：：對于微量或少量的血液樣品，可以在*步中不進行離心棄上清的操作，直接在第二步 中加入10倍血液體積的紅細胞裂解液，并在室溫或4℃裂解4-5分鐘。對于鼠的血液，裂解4-5 分鐘已經足夠，對于人的外周血，宜延長裂解時間至10分鐘，但通常不宜超過15分鐘，并且 裂解過程中宜適當偶爾搖動以促進紅細胞裂解。后續步驟相同。

D. .. 對于血液樣品無需洗滌的快速操作步驟 D. 對于血液樣品無需洗滌的快速操作步驟 對于血液樣品無需洗滌的快速操作步驟：：：：

a. 每1ml新鮮抗凝血中加入10ml紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解4-5分鐘。本步驟在室 溫或4度操作均可。注意：對于鼠的血液，裂解4-5分鐘已經足夠，對于人的外周血，宜 延長裂解時間至10分鐘，但通常不宜超過15分鐘，并且裂解過程中宜適當偶爾搖動以促 進紅細胞裂解。

b. 加入20-30ml PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養液，混勻。

c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

d. 如果發現紅細胞裂解不*，可以重復上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細胞不 會影響后續的一些檢測。

e. 根據實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數等后續實驗。

注：：：：對于常規步驟，多一步洗滌過程的離心，但可以節省洗滌液的用量，并且洗滌效果也更 好一些，同時不需要大體積的離心管?？焖俨襟E少了一次離心，但洗滌效果略差一些，同時 需要大體積的離心管。

11.. . . 人或各種動物中性粒細胞分離液試劑盒使用方法說明及圖例 各種動物中性粒細胞分離液試劑盒使用方法說明及圖例

Store at：：：RT 試劑盒規格：：：：2×100ml/Kit

試劑盒內容：全血及組織稀釋液 100ml

細胞洗滌液 100ml

試劑 A 2×100ml

紅細胞裂解液 100ml

說明書 1 份

操作方法：：：：

A．取 1ml 新鮮抗凝血，與全血及組織稀釋液 1:1 混勻后小心加于 1 份 A 液之液面上；或取

1ml 組織單細胞懸液（具體制備方法詳見 9.組織單細胞懸液的制備）小心加于 1 份 A 液

之液面上；

B. 以 500g（約 1800 轉/分）離心 25 分鐘(半徑 15cm 水平轉子)。

此時離心管中由上至下細胞分四層。*層；為血漿層。第二層；為環狀乳白色的單個

核細胞層。第三層；；；；為略帶混濁的分離液層 為略帶混濁的分離液層 為略帶混濁的分離液層（富集一定量的中性粒細胞 富集一定量的中性粒細胞 富集一定量的中性粒細胞）。。。。第四層；為紅細胞層。棄去*層血漿層及第二層細胞，收集第三層分離液層和第四層紅細胞層 收集第三層分離液層和第四層紅細胞層,放入含細胞洗滌液（Cat#：2010X1118）10ml 的試管中，充分混勻后，以 500g 約（1800 轉/分）離心30 分鐘。沉淀經 1 次洗滌后用紅細胞裂解液（Cat#：NH4CL2009）裂解紅細胞，再經 3 次洗滌去除紅細胞內溶物和碎片后取沉淀細胞即為所需中性粒細胞。

注：A.提取率約為 80%。 注

B. 紅細胞裂解過程詳見“10.紅細胞裂解液使用說明”。

13. . . . 參考文獻

［1］ Meier C, Middelanis J, Wasielewski B, et al. Spastic paresis after perinatal

brain damage in rats Is reduced by human cord blood mononuclear cells［J］. Pediatric

Research, 2006,59(2):244-249.

［ 2］ Boyle AJ, Schulman SP, Hare JM , et al. Stem cell therapy for cardiac

repair:ready for the next step［J］. Circulation, 2006, 114(4):339-352.

［3］ 程范軍,鄒 萍,楊漢東,等.人臍血間充質干/ 祖細胞誘導為心肌樣細胞的實驗研究［J］.

中華器官移植雜志,2003,24:220-222.

［4］Dennis JE,Charbord P.Origin and differentiation of human and murine stroma

［J］.Stem Cells,2002,20(3):205.

［5］ Yu JC, Daniel TS, Ching PT, et al. Disparate mesenchyme-lineage tendencies

in mesenchymal stem cells from human bone marrow and Umbilical Cord Blood［J］. Stem

Cells, 2006,24(3) : 679-685.

［6］ Compagnoli C, Roberts IAG, Kumar S, et al. Identification of mesenchymal

stem/progenitor cells in human first trimester fetal blood, liver and bone marrow

［J］. Blood, 2001,98:2396-2402.

［7］ Miura M, Gronthos S, Zhao M, et al. SHED: stem cells from human exfoliated

deciduous teeth［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100:5807–5812.

［8］ 遲作華, 張 洹, 何冬梅, 等. 臍血間充質干細胞培養條件的優化［J］. 中國實用內

科雜志,2006, 26(5):372-375.

［9］ 向 靜, 江德鵬, 王昌銘，等. 臍血單個核細胞體外培養和誘導后神經干細胞標志物

mRNA 的表達［J］. 重慶醫科大學學報,2005 ,30 (3):352-355.

［10］ 孫海梅，季鳳清，李榮平，等.不同培養條件下人臍血間充質干細胞的差異［J］. ***， www.tbdscience.com

2006, 10( 45 )：51-53.

［11］ 朱美玲，伍新堯，陳汝光，等.不同分離方法分離臍血造血細胞效率的比較［J］. 中

國輸血雜志,2002 , 15 (3):179-780.

［12］ 鄭德先，吳克復，褚建新.現代實驗血液學研究方法與技術.北京醫科大學中國協和

醫科大學聯合出版社，1999.

［13］ 鄂征.組織培養.北京出版社，1995.

［14］ 朱立平，陳學清.免疫學常用實驗方法.人民軍醫出版社，2000.