PCR的用途及使用方法

真核生物的基因組是DNA，為什么不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢？因為真核生物的基因含有大量的非編碼區，稱為內元（intron），真正編碼蛋白的區段是被這些內元隔開的，這些編碼區叫做外元（exon）。真核生物的DNA轉錄成為RNA之后，經過剪切和拼接，去掉這些非編碼區，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻譯成蛋白質。

所以，如果直接從真核生物的基因組DNA獲取目的基因，克隆再表達，試圖獲取目的蛋白的思路是行不通的，因為獲取的DNA里面會含有非編碼區。要表達真核生物的基因并表達出相應的蛋白，只能通過提取其mRNA并RT-PCR這條頗費周折的途徑。

1．RNA的提取

RNA的提取其實原理很簡單：通過變性劑破碎細胞或者組織，然后經過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經過沉淀，洗滌，晾干，后溶解。但是由于RNA酶無處不在，隨時可能將RNA降解，所以實驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。

1．1 分離高質量RNA

成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA至少應保證全長并且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質量決定了你能夠轉錄到cDNA上的序列信息量的大值。一般的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍／酸性酚的一步法。

一般不必使用oligo（dT）選擇性分離poly（A）+RNA。不管起始模板是總RNA還是poly（A）+ RNA，都可以檢測到擴增結果。另外，分離poly（A）+RNA會導致樣品間mRNA豐度的波動變化，從而使信息的檢出和定量產生偏差。然而，當分析稀有mRNA時，poly（A）+RNA會增加檢測的靈敏度。

1．2 RNA提取的大影響因素-RNA酶

在所有RNA實驗中，關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩定，可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等，RNA酶催化的反應一般不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結果，所以RNA的制備與分析操作難度很大。

在實驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要大限度地抑制內源性的RNA酶。外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其它分子生物學實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細胞中則含有大量內源性的RNA酶。

1．3 常用的RNA酶抑制劑

*焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不*的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。

*異硫氰酸胍：目前被認為是有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。

*氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態類物質，幾乎能*抑制RNA酶的活性。

*RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。

*其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。

1．4 防止RNA酶污染的措施、RNA提取之前需要注意和準備的工作

*盡可能在實驗室專門辟出RNA操作區，離心機、移液器、試劑等均應。RNA操作區應保持清潔，并定期進行除菌。

*操作過程中應始終戴一次性橡膠手套和口罩，并經常更換，以防止手、臂上的細菌和真菌以及人體自身分泌的RNase帶入各種容器內或污染用具。盡量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不僅常常給操作帶來不便，而且塑料手套的多出部分常常將器具有RNase處傳遞到RNase-free處，擴大污染。

*盡量使用一次性的塑料制品，避免共用器具如濾紙、tips、tubes等，以防交叉污染。例如，從事RNA探針工作的研究者經常使用RNase H、T1等，在操作過程中極有可能造成移液器、離心機等的污染。而這些污染了的器具是RNA操作的大敵。

*關于一次性塑料制品，建議使用供應的出廠前已經滅菌的tips和tubes等。多數供應的無菌塑料制品很少有RNase污染，買來后可直接用于RNA操作。用DEPC等處理的塑料制品，往往由于二次污染而帶有RNase，從而導致實驗失敗。

*所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。

*無法用DEPC處理的用具可用氯仿擦拭若干次，這樣通常可以消除RNase的活性。

*配制溶液用的乙醇、異丙醇、Tris等應采用未開封的新瓶裝試劑。

*塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。

*有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。

*配制的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經0.22μm濾膜過濾除菌。

1．5 RNA提取的一般步驟

RNA提取的一般步驟是：破碎組織→分離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA

破碎組織和滅活RNA酶可以同步進行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。

分離RNA一半用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經過此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開。

沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或異丙醇。

洗滌RNA使用70％乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。

融解RNA一般使用TE。

保存RNA應該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩定。另外，長度大于4kb的轉錄本對于痕量RNase的降解比小轉錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當準備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g離心5分鐘。

1．6RNA抽提新方法-TRIZOL法

TRIZOL試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。共純化DNA對于樣品間標準化RNA的產量十分有用。

TRIZOL是有毒物，接觸皮膚或者不慎吞服，會導致灼傷，一旦接觸皮膚后立即以大量的洗滌劑和清水清洗。TRIZOL在室溫下能穩定保存12個月。盡管如此，為達到佳效果，建議保存在2-8°C的環境下。

2．RT-PCR

RT-PCR是指將逆轉錄（Reverse Transcription；RT）反應和PCR （Polymerase Chain Reaction）反應組合在一起的方法。

2．1 RT-PCR的原理

RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結合在一起，提供了一種分析基因表達的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對表達信息進行檢測或定量。另外，這項技術還可以用來檢測基因表達差異或不必構建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內的RNA分析技術，更靈敏，更易于操作。

RT-PCR的模板可以為總RNA或poly（A）+選擇性RNA。逆轉錄反應可以使用逆轉錄酶，以隨機引物、oligo（dT）或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在佳條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉錄緩沖液中進行，然后取出1/10的反應產物進行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉錄和PCR在同時為逆轉錄和PCR優化的條件下，在一只管中順次進行。

2．2 RT-PCR的步驟

⑴在冰浴離心管里面加入模板RNA 4uL，引物2uL，去離子水5uL，混勻，離心3-5秒；

⑵70度水浴5分鐘，冰浴30秒（此處是為了使引物和模板正確配對）；

⑶加入5×反應液4uL，RNase抑制劑1uL，dNTP 2uL（這些應該先配好，然后分再裝到每一管），混勻；

⑷37度水浴5分鐘，加入1uL AMV-RT反轉錄酶，混勻；

⑸37度水浴1小時（此步是反轉錄過程）；

⑹70度10分鐘結束反應（此處是滅活酶活性，避免對后續實驗產生干擾），產物置冰上進行下一步PCR實驗，余下的-70度保存。

2．3 RT-PCR的引物設計

RT-PCR引物設計和一般PCR引物設計可以遵循同樣的原則。細心地進行引物設計是PCR中重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會同擴增其他的非目的序列。設計理想的引物都有以下共同的特點，而設計失敗的引物則各有各的缺點：

* 典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列*性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。

* 選擇GC含量為40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。

* 設計5'端和中間區為G或C的引物。這會增加引物的穩定性和引物同目的序列雜交的穩定性。

* 避免引物對3'末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。

* 避免3'末端富含GC。設計引物時保證在后5個核苷中含有3個A或T。

* 避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。

* 避免存在可能會產生內部二級結構的序列，這會破壞引物退火穩定性。

目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當計算引物Tm值時并不包括這些序列，但是應該對其進行互補性和內部二級結構的檢測。

引物的穩定性依賴于儲存條件。應將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）多可以保存2個月。

2．4 引物退火溫度

引物的另一個重要參數是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm低5℃。

根據所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm 5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。為獲得佳結果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會由于在循環中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比低的Tm低5℃。或者為了提高特異性，可以在根據較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環，然后再根據較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環。這使得在較為嚴謹的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。