將活體細胞作為治療藥物進行移植的治療方法為許多急性病和慢性病提供了新型的治療選擇。然而細胞的生物復雜性卻限制了細胞治療從實驗室規(guī)模放大到可靠、經濟的生產規(guī)模。我們在這里提出一種應對以上挑戰(zhàn)的解決方法——通過質量源于設計(QbD)的原則來設計細胞的生產工藝。QbD將科學知識與風險評估整合到了生產工藝開發(fā)中，并已被生物制藥工廠所接受。雖然仍需進一步的技術開發(fā)才能*實現(xiàn)，但在細胞治療生產工藝中存在著大量可以與QbD聯(lián)合的機會。而通過QbD鏈接可測分子，細胞群細胞特性與zui終產品質量是實現(xiàn)細胞治療醫(yī)療轉變的關鍵步驟。

過去十年使用細胞作為治療藥物的細胞治療領域得到了的增長。雖然*個造血干細胞移植可以追溯到19世紀50年代，但對于不同適應癥的細胞療法卻是隨著臨床細胞的培養(yǎng)技術突破而從近期才開始的。生產臨床應用的細胞治療產品通常需要以下步驟：獲取或生成起始細胞株；培養(yǎng)；改造；收獲；濃縮；純化；制劑，zui終罐裝（以特定濃度和成分條件制備細胞治療產品， 分裝到zui弱產品的“容器”中，以及其它分裝后過程）；儲存；以及產品運輸。雖然這些步驟與從哺乳細胞中生產治療蛋白的過程是相似的，但因為活體細胞的高度復雜性，對其作用機制的不*了解，產品性質的不同以及初始材料的多樣性使得細胞治療產品的生產更為挑戰(zhàn)。而以上這些嚴峻的挑戰(zhàn)都可以利用QbD來進行解決，而在新的技術方案的放大實現(xiàn)中，產品的研發(fā)和生命周期的管理都是監(jiān)管機構所推崇的。

2002年，美國FDA引進了cGMP倡議來應對藥物生產失敗追尋其潛在原因時的低效及挑戰(zhàn)，并在2006年協(xié)調會議上概述了QbD的框架，用系統(tǒng)的方法基于科學知識與風險評估來進行工藝和產品管理。今天，隨著小分子制藥生產對QbD的廣泛接受，越來越多的生物制藥生產也開始將QbD原則貫徹到它們的工藝中。雖然一些監(jiān)管機構，如Health Canada， 目前只接受了針對于典型化藥和生物藥的以QbD為基礎的建議書，而在細胞為基礎的治療方法中使用QbD可以極大的提高對工藝和產品的理解和產出。事實上，細胞治療產品的生物復雜性使QbD的迭代原則尤為貼近于這種治療方式。

這里我們回顧了主要的QbD概念（BOX 1）并討論其在四個臨床在研細胞治療產品中的應用：多功能干細胞誘導的心肌細胞，造血干、祖細胞(HSPCs)，間質干細胞(MSCs)和嵌合抗原受體(CAR)-T細胞(表1)。

這四種細胞治療產品吸引了眾多醫(yī)藥公司爭相投資。在新興的PSC誘導的治療方法中，Ocata Theerapeutics (美國)公司針對致盲癥的PSC誘導視網膜細胞療法已經進入臨床實驗，目前已經被Aslas Pharma(東京)公司以3.79億美元收購，Novartis(瑞士)公司投資了3500萬美元給Gamida Cell(以色列)公司的臍帶血擴增技術，并達成與Regenerex(美國)公司在HSPC產品上的*許可與合作事宜。2010年Mesoblast(紐約)公司與Cephalon(現(xiàn)在是Teva公司的子公司，以色列)達成了一項20億美金的MSC技術合作項目。針對惡性疾病的CAR-T細胞療法是Novaritis與賓州大學(費城)；Pfizer公司(紐約)與Cellectis公司(巴黎)；Amgen公司(美國)與Kite公司(美國）；GlaxoSmithKline公司（倫敦）與Adaptimmune公司(英國)；Celgene公司(美國)與Bluebird公司(美國)；Celgene公司與Juno Therapeutics(西雅圖)合作與收購的主題。然而即使這些或其它的細胞療法已經有了令人興奮的臨床進展，但生產中仍有許多挑戰(zhàn)需要克服。QbD提供了一個合理的框架來應對這些挑戰(zhàn)并促進細胞療法作為一種常規(guī)治療選擇的實現(xiàn)。如果這些挑戰(zhàn)不被解決將導致全行業(yè)都無法實現(xiàn)在可控成本條件下生產出高質量的產品，也會影響范圍內>600個再生醫(yī)學臨床實驗的產業(yè)化。

應用QbD進行細胞生產

生物反應器系統(tǒng)因其可規(guī)模化，易于集成檢測技術及可以自動響應來維持環(huán)境均一性等特點，成為生產治療型蛋白所需的細胞培養(yǎng)方法。然而，這些系統(tǒng)是為了獲得高蛋白產量而設計的，而不會優(yōu)先考慮細胞本身。相比之下，細胞治療產品生產過程中生產出的健康的功能細胞對環(huán)境因素有高度的敏感性。許多生物反應器類型，細胞生產模式，規(guī)模和控制參數(shù)目前已經可以應用于細胞治療產品生產中(圖1)。了解這些不同的“模塊”的性能和它們如何應用于細胞治療產品生產對于QbD是至關重要的，相反也可以應用QbD更深入了解以上要點。

QbD包括產品和工藝描述，表征，設計，監(jiān)控和持續(xù)改進(圖2)。而這些都由對基本生物學和某一產品及其工藝工程的深入了解來指導。

QbD由目標產品質量概況(目標產品的質量指標； QTPP)，直接影響產品安全性和有效性的定義屬性(關鍵質量屬性)，通過定義這些會影響性能的參數(shù)(關鍵過程參數(shù))和建立設計空間來限制影響質量屬性的參數(shù)變異。接下來，開發(fā)控制策略來保持過程參數(shù)在一個范圍內來確保產品質量，并且在放大過程中進行工藝驗證。相對于傳統(tǒng)的基于離散點的控制策略，QbD標識了一個可以生產出高質量產品的可以接受的操作區(qū)域或多元設計空間。一旦實施，這個生產工藝被監(jiān)控且隨著對工藝的深入理解可以被不斷改進(圖3)。

目標產品質量概況(QTPP)

QTPP描述了所需終產品的屬性，如一致性，效力和純度，這也是QbD的起點。我們展示了四個細胞治療產品的QTPP作為舉例(圖2)。重要的是，每個細胞治療產品的一致性，效力和純度的定義取決于各自使用的療法。定義嚴格，標準容易衡量是建立QTPP的關鍵。

鑒定  對于蛋白和小分子藥物，鑒定由分子組成來定義。然而，細胞鑒定(即，表型)是復雜的連續(xù)體，通常知之甚少。鑒定通常可以通過細胞表面某種功能活性相關的標志蛋白存在與否來證明，鑒定使用流式細胞術。然而，這種方法可能會遺漏其它由生產工藝或工藝改變引起的表達變化的信息標志。對細胞效力穩(wěn)定快速的生物分析可以緩解這些擔心，但也需要更多的關注標準化鑒定分析。在體內鑒定與血液重構相關的細胞表面標志性質廣泛應用到了對造血系統(tǒng)研究中的鑒定上。在一些情況下，多種細胞類型的存在有助于臨床，這被反應在鑒定屬性上。在2006年，MSC的zui小鑒定標準被提出，這些細胞主要作為多功能細胞代替治療被開發(fā)出來。如今，熱點在于免疫分子聯(lián)合含有不同性質MSC的更廣泛組織來源，而這需要新的鑒定標準來確定治療相關的分群。在CAR-T工藝中，目標細胞群必須表達嵌合抗原受體（CAR）和正確的T細胞標記。可以用于鑒定產品及區(qū)分未轉換T細胞和不良的已轉入CAR的細胞，隨著越來越多特異性CAR被開發(fā)出來，開發(fā)出可以鑒定非需、與細胞治療產品共反應的可靠檢測將成為必需。

效力  細胞治療產品不僅要有正確的同一性，他們的功能也必須與體外的功能分析中表現(xiàn)的一致。檢驗這些功能的關鍵因素是效力，它能測量藥物活性，是評價工藝過程變化所帶來的影響的重要手段。測試分泌細胞因子的生物活性將是一種更合適的效價測定方法。在前面的例子，CAR-T細胞破壞靶細胞作為細胞工程的結果，其作用機制能被更好地理解。CAR-T細胞與表達適當?shù)陌锌乖毎谝黄鸱跤梢杂脕砹炕疶細胞脫顆粒，細胞因子的釋放，以及其在體外的增殖和細胞毒性。CAR-T細胞由于具有同一性，單一的檢測不能充分定性其多種方式的效力。

效力與力量不同，有劑量依賴性。兩種藥效等效的藥物中，較低強度藥物是藥物。同樣，從風險和成本的角度來看，在低強度或可行的細胞密度下，具有力的細胞治療產品是。很多方法可用于確定細胞密度和存活力，各有優(yōu)缺點。制造商應該仔細考慮哪種方法對產品zui合適，并確保所獲得的數(shù)據反映了預期用途。例如，細胞密度和活力往往是通過測量中間代謝活動來間接測量，可以被其他因素影響，包括改變種群構成，線粒體的含量或活性，底物充足、生長介質的氧化還原狀態(tài)或溫度。

純度  細胞治療產品的雜質可以包括不合需要的細胞類型，污染，輔助材料和微粒。細胞純度的閾值在治療之間有所不同。心肌細胞治療，移植心肌細胞瞬時節(jié)點誘發(fā)心律失常，而非心臟細胞與心臟組織沒有電磁耦合，也可能導致心律失常。在PSC來源的細胞治療，僅有1/4000剩余的未分化 PSCs也會導致畸胎瘤。雖然這個閾值低于流式細胞儀檢測水平–基于表型分析，zui近描述的方法例如對心肌細胞的代謝選擇或者抗PSCs的篩選可以大大降低這種風險。，在雙臍帶造血干祖細胞移植中，T細胞雜質可以引起免疫并發(fā)癥，雖然T細胞和其他細胞在移植中也有輔助功能。骨髓間充質干細胞是已知的多功能細胞，而在CAR-T細胞療法，增生性幼稚或中央記憶T細胞在zui后CTP（細胞治療產品）中的比例可能影響療效。對于基因工程改造獲得的細胞治療產品，純度分析必須確定所需的改進型細胞的頻率，其他類型的細胞，和任何的遺傳工程帶來的脫靶效應。

細胞培養(yǎng)對各種污染很敏感，顯著的微生物（細菌、真菌、支原體）、內毒素和細胞交叉污染，使他們不適合使用。此外，由制造設備和材料所產生的非細胞的顆粒物（包括塑料碎片，殘留的載體和纖維）必須被嚴格控制。CTPS的生產一般需要生物活性物質的雞尾酒，包括細胞因子、小分子、血清和載體。這些輔助材料必須充分除去，以免被視為藥物本身。他們也可以改變其他過程生物可變因素。例如，二甲基亞砜，常用的冷凍保護劑，可以增加增塑劑從生物反應器管道中浸出，和pH值指標可以影響細胞的分化。因此，質量目標產品配置文件必須描述這些輔助材料在zui終產品中的zui大殘留水平以確保其安全性，而且需要有額外的處理以免影響zui終的細胞產量。

關鍵質量屬性和關鍵工藝參數(shù)

在開發(fā)制造工藝流程時，確定能保證產品質量的決定性屬性是必須的。這些關鍵質量屬性可以是物理的，化學的，生物學的，或微生物特性或特征，且應在適當?shù)南薅龋秶蚍植家员ＷC預期的產品質量。換句話說，關鍵質量屬性是QTPP屬性，直接關系到產品的安全性和有效性，包括那些在表2中列出的屬性。

關鍵質量屬性受關鍵工藝參數(shù)和原材料屬性變化的影響，必須加以控制。關鍵工藝參數(shù)包括細胞功能特征如生長動力學、細胞年齡、細胞分泌的因子或特異基因的表達，而非細胞特征，如原材料屬性、物理化學參數(shù)（pH、溶解氧、溫度）或外源因子的濃度。闡明相關的關鍵質量屬性、關鍵工藝參數(shù)和原料屬性，包括進行實驗、機制建模、使用先驗知識和應用廣泛的分析技術。

一旦確定了這些參數(shù)和屬性，就進行風險評估，按重要性對zui有影響的關鍵工藝參數(shù)和材料屬性進行研究（圖2）。關鍵質量屬性直接決定產品的質量，而關鍵的工藝參數(shù)和材料屬性的影響關鍵質量屬性間接影響產品質量。一些關鍵質量屬性可能與可識別的關鍵工藝參數(shù)和材料屬性無關（圖3）。

關鍵質量屬性指導工藝過程和產品開發(fā)，并應隨著工藝過程知識的發(fā)展而不斷改良。早期的工藝發(fā)展過程中，一個基礎廣泛的多參數(shù)細胞屬性的分析對于確定在以后的開發(fā)階段集中在一組更為明確的的關鍵參數(shù)是有用的。值得注意的是，識別和測量關鍵質量屬性的取值是具有挑戰(zhàn)性的。若不首先對關鍵質量屬性有所理解，復雜的多參數(shù)研究（“設計空間”下面討論）可能價值有限，這些研究確定多種參數(shù)對關鍵質量屬性的影響。因此，早期CTP的發(fā)展應著眼于確定關鍵質量屬性，隨著這些基礎知識的增長，日益成熟的經驗或機制實驗模型可以用來探索的關鍵工藝參數(shù)和材料特性的影響。

產品的安全性和有效性受許多過程參數(shù)的影響，包括生物反應器系統(tǒng)的操作特性。例如，攪拌不僅可以確保均勻的環(huán)境條件也改變剪切敏感的細胞表型。溶氧影響PSCs，HSPCs和間充質干細胞，對效力和純度有潛在影響。即使輕微的pH值變化也會產生重大影響，如果不加以控制，細胞代謝會降低pH值。代謝副產物也會直接影響結果。例如，乳酸的積累和pH值的降低與細胞生長受抑制和PSC 表型損失有關。媒介交換率和策略（例如，批，分批或灌注）可以用來控制廢物和內源分泌因子積累。

CTP生產中使用的反應物不斷改進。許多候選的CTPs，來源于復雜的血清基質培養(yǎng)在成纖維細胞上，越來越傾向于通過化學限制性培養(yǎng)基來培養(yǎng)，無異物，cGMP配方，以減少工藝的可變性。然而，起始試劑的可變性（基礎培養(yǎng)基、重組蛋白、小分子和起始細胞來源）仍然存在，必須加以量化。減少培養(yǎng)基的組分的策略將減少所需cGMP等級數(shù)，減少大量需驗證的試劑。生長因子和小分子在小批量臨床開發(fā)中往往不易獲得，而且價格昂貴，生長因子活性變化很大，可能對過程結果產生重大影響。基于標準化和一致的細胞活性檢測，或是結構敏感的生化檢測，以減輕相關風險。

細胞擴大通常是一個經濟考慮，但如果它影響CTP質量，可能是一個重要的質量屬性.對于病人具有特定性的CTPs，細胞擴大實現(xiàn)的程度可能影響劑量。生產HSPC和CAR-T療法來源于單一供體的細胞需要足夠的細胞擴張以達到靶劑量。相比之下，異源的 CTPs，需要重點考慮細胞老化和穩(wěn)定性。延長的細胞擴大和酶分離現(xiàn)象也會導致基因異常的累積。細胞數(shù)量的從而影響效力（削弱的分化潛能）和純度（增加的變異細胞）。

細胞信號因子的分泌可能是一個效能屬性或一個關鍵的過程參數(shù)。在PSC系統(tǒng)中，自分泌和旁分泌信號是需要的，以維持多功能表型。類似地，向心肌細胞分化的過程中，循環(huán)灌注料可以緩解骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）的激動劑和拮抗劑累積所帶來的心室樣細胞純度降低。培養(yǎng)HSPC也會有這種情況，分泌型細胞因子的積累是 CTPs質量的主要決定因素，因此也是一個關鍵的過程參數(shù)。相比之下，MSCs通過免疫調節(jié)因子的分泌獲得療效，從而代表一個關鍵質量屬性。持續(xù)發(fā)展的可測量分泌因子的在線傳感器系統(tǒng)將提高我們對細胞培養(yǎng)中分泌因子的理解和控制能力。細胞擴大過程取決于起始細胞數(shù)量和所用試劑的質量。HSPC擴張產量變化與起始細胞群的表型（CD34 +的分數(shù)）非線性相關。篩選系統(tǒng)已發(fā)展到可以量化觀察PSC分化潛能的可變性；由于捐贈者個體的差異CAR-T細胞治療在細胞輸入量和所輸入細胞得組分方面，具有高度的可變性。這些療法的效力與細胞增殖的相關性，療效可能通過選擇特異性細胞亞型而受掌控。在病人特異性的細胞治療療法中，捐贈者的差異與同種異源療法一樣，可以通過QbD方法加以系統(tǒng)研究從而控制或減輕這種變異的來源。

產品設計空間

設計空間描述關鍵工藝參數(shù)和關鍵質量屬性材料的交互作用和變化范圍，或“正常操作范圍”，這與保持產品質量是相容的。關鍵工藝參數(shù)的可變性與CTP生產特別相關，因為輸入細胞的可變性和關鍵工藝參數(shù)之間的復雜相互作用，必須相應地加以調整。設計空間內的更改不被視為工藝變更，因為它們對關鍵質量屬性的影響已經被研究并確定是可以接受的。QbD 的這一特征極大地減少了管理機構的負擔。FDA的觀點是，在可靠的科學數(shù)據和健全的質量體系基礎上改變設計空間內的操作參數(shù)不需要發(fā)布通告。此外，定義良好且經過驗證的設計空間不需要進行大量的內部測試，因為系統(tǒng)的性能已經得到了描述（只剩下發(fā)布測試作為主要測試步驟）。

設計空間是在多因素過程、實驗和系統(tǒng)建模的基礎上發(fā)展起來的。我們舉例說明了一個關鍵工藝參數(shù)和一個材質屬性的設計空間（圖2）。雖然在一個復雜的CTP系統(tǒng)中建立一個高度自信的設計空間是具有挑戰(zhàn)性的，有兩個互補的工具可以用來指導設計空間開發(fā)：實驗設計（DOE）和系統(tǒng)建模。

實驗設計

DOE描述了一組方法，對于有組織和有結構的科學研究，以理清因素和結果之間的關系。生物反應器的控制下，使得對細胞在響應一系列關鍵工藝參數(shù)的變化后的行為做出系統(tǒng)評價成為可能，從而識別*操作條件和闡明產品工藝的設計空間。已有的方法可以在統(tǒng)計學上有意義的探索和多參數(shù)過程的界定方法涉及到一系列的測試來確定輸入變量（單獨或組合）對結果的影響。DOE可以用來開發(fā)由傳統(tǒng)方法逐步優(yōu)化看起來高不可攀高度的過程，從而增加過程的健強性和成本效率，此外它還可以用來進行綜合成本分析。多參數(shù)研究將受益于使用新的小規(guī)模生物反應器系統(tǒng)來開發(fā)關鍵工藝參數(shù)的響應面（方框2）。

基于DOE的相互作用的兩個關鍵工藝參數(shù)的影響的調查（播種密度、攪拌速率）對PSC培養(yǎng)確定了工藝優(yōu)化，逐步實驗可能會錯過。關于播種密度的相似研究，培養(yǎng)基體積和補料時間使用響應面分析法以確定細胞分裂之后細胞*產量的條件。在對HSPC 的研究中，我們早期研究細胞擴大所必需的細胞因子，多個研究采用了DOE方法的探索和優(yōu)化細胞培養(yǎng)。從造血干細胞產生中性粒細胞，有研究發(fā)現(xiàn)此過程受四種細胞因子的交互作用所控制，這一過程如果沒有DOE方法不可能被發(fā)現(xiàn)，使用細胞因子的簡化模型也不可能發(fā)現(xiàn)。在對MSC的研究中，初步設計空間已經確定了不同的微載體，細胞接種密度，葉輪幾何參數(shù)對zui終細胞擴大的影響。

DOE必須將關鍵過程參數(shù)不僅與細胞擴大相關的關鍵質量屬性起來，而且還要與身份、效力和純度屬性相關聯(lián)。我們強調的是多參數(shù)的調查應該只針對zui重要的關鍵質量屬性；過度分析風險識別無關的特性，可能導致對生產過程中的狀態(tài)信息的誤導。隨著過程知識的發(fā)展，對關鍵質量屬性和關鍵過程參數(shù)的反復評估有助于消除不相關參數(shù)的研究。

系統(tǒng)建模

鑒于細胞與環(huán)境之間相互作用的復雜性，系統(tǒng)建模將使得開發(fā)設計空間獲益巨大。大組學數(shù)據集提供了構建減少參數(shù)的機制模型的出發(fā)點，這一模型將關鍵工藝參數(shù)與關鍵質量屬性起來（圖3）。盡管迄今為止還沒有產生過這樣的模型，但各種各樣的模型技術已被用于整合細胞和生物信號，以預測與CTP生產相關的關鍵質量屬性。干細胞過渡狀態(tài)的劃分模型指導微環(huán)境調控和培養(yǎng)補料策略。基于組學數(shù)據的代謝途徑分析和重建已被廣泛應用于優(yōu)化生物制藥生產并適用于CTP生產。這些分析，描述了特定氨基酸對于PSC 培養(yǎng)的關鍵性，而代謝通量分析已被用于描述在不同的氧水平PSCs 指數(shù)生長時代謝通路的活性，以預知培養(yǎng)基的配方。zui近，PSCs 來源的心肌細胞不同的乳酸代謝模型已被利用來實現(xiàn)高純度的心肌細胞，表明基于代謝建模來優(yōu)化CTP生產是可行的。

隨著產品的發(fā)展，大量的有價值的數(shù)據積累起來。將這些數(shù)據關聯(lián)到關鍵質量屬性，以建立起網絡模型達到預測目的技術得以開發(fā)。例如，統(tǒng)計工具如多元分析可以識別基因的子集（或其他元素）在組學數(shù)據，這些數(shù)據與所期待反應有關。這種方法確定了多種樣品中的起始和zui終的HSPC的種群構成，這一種群構成是一個關鍵的工藝參數(shù)，可被用于作為其他病人特定治療的起始材料變異性種群構成的參考。基于擴展模型以識別關鍵過程參數(shù)，基于基因表達數(shù)據集，模型設計空間的發(fā)展，需要與確定關鍵工藝參數(shù)相關的基因調控網絡的預測和驗證。zui近關于輸入因子與變化的細胞狀態(tài)的相關性計算表明，基因調控網絡可以鏈接關鍵工藝參數(shù)和關鍵質量屬性。CTP領域的有價值的下一步是使用建模技術將表型與效力起來。

控制策略

過程分析技術是一種設計、測量、監(jiān)測和控制關鍵過程參數(shù)（包括pH值、溶氧、溫度、密度和營養(yǎng)水平）的方法，是QbD的一個重要元素。生物制藥的生產工藝使用先進的控制策略實現(xiàn)對工藝變量的在線監(jiān)測和控制，這些技術同樣適用于CTP生產。的確，CTPS與其他生物制劑相比而言增加的復雜性，為更先進的監(jiān)測和控制策略的創(chuàng)造了一個很好的機會。zui近，我們的團隊展示了在人類臍帶血擴大工藝中，實時監(jiān)控和控制可溶性信號因子，以增加細胞的產出。分泌因子的測量和控制，細胞群組成和其他先進的工藝參數(shù)，這些因素的重要性在細胞療法中越來越被認可。

QbD的未來應用

盡管CTPs生產的產業(yè)化面臨諸多挑戰(zhàn)，其前景十分樂觀。幾十年細胞培養(yǎng)產業(yè)化工藝設計的經驗，提供了在生物反應器的放大和強化，細胞代謝，培養(yǎng)基設計，補料策略優(yōu)化和工藝過程控制方面的工業(yè)化基礎。我們對細胞與環(huán)境相互作用的理解認識正在提高，能夠控制細胞環(huán)境的生物反應器系統(tǒng)，正在生成越來越集中于分子和細胞信息的數(shù)據集。與此同時，我們對細胞狀態(tài)的分子基礎的認識，包括粘附依賴，代謝網絡狀態(tài)，集落形成和增殖的控制，正在不斷提高。雖然我們在此集中討論的是上游生產工藝過程，QbD對下游操作同樣適用。同樣，工藝設計只是產品生命周期的一部分，利用這里描述的QbD工具為CTP生命周期創(chuàng)造了靈活可變又經得起檢驗的工藝。

CTPs的未來取決于細胞生產低成本技術的發(fā)展。鑒于CTPs固有的復雜性和它的生產工藝，將今天試驗中CTPs轉換成廣泛使用的藥物，QbD方法是*的。