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隨著新藥研發成本持續攀升，精準治療需求不斷增長，小核酸藥物正成為生物醫藥研發中備受關注的方向之一。在功能基因組學和靶向藥物研發中，siRNA高通量篩選可用于解析基因功能、挖掘疾病相關靶點，并支持RNA干擾藥物研發中的前期篩選工作。

siRNA篩選流程通常涉及文庫制備、轉染條件優化、細胞鋪板、樣本處理和檢測分析等多個步驟。傳統手工操作在高通量場景下容易受到移液誤差、通量限制、重復性波動、邊緣效應和人力成本等因素影響，從而影響實驗執行效率和數據一致性。

貝克曼庫爾特生命科學 Biomek i-Series 自動化液體處理工作站 與 Echo 聲學液體處理系統 可應用于siRNA篩選流程中的多個關鍵環節。Biomek適合整板化、多通道、自動化液體處理和流程整合；Echo可通過聲學移液實現納升級至低微升級的非接觸式液體轉移，適用于珍貴siRNA樣本、轉染脂質和小體積反應體系的精準分配。

通過將自動化液體處理平臺應用于siRNA篩選流程，研究人員可在文庫制備、轉染優化、細胞處理和檢測前處理等環節提升流程一致性，并更高效地開展多條件、多細胞系和多讀數實驗。

01 轉染條件優化：DOE自動化，系統比較多因素組合

siRNA轉染效果受到細胞類型、細胞密度、核酸用量、轉染試劑類型、轉染試劑用量、復合物孵育時間和檢測方式等多因素影響。不同細胞系往往需要通過條件優化來確定合適的轉染體系。自動化DOE實驗設計有助于在統一流程下比較多種條件組合，減少手工操作帶來的時間差和孔間差異。

Biomek實驗示例

在Biomek實驗示例中，細胞鋪板采用HEK293細胞，使用96孔平底黑壁透底板，設置25,000和50,000 cells/100 μL兩種鋪板密度，并按列分布以便進行條件對比。鋪板后通過i3X MiniMax成像確認細胞沉降和狀態。

轉染體系根據試劑說明進行設置，比較DNA 100 ng/孔與400 ng/孔，Lipofectamine 0.15 μL/孔與0.3 μL/孔，P3000按說明書比例添加，Opti-MEM作為稀釋體系。

在關鍵時序控制上，Biomek可對每種預混體系自動錯開啟動，使“混合至有效載荷加樣”的孵育時間統一為12分鐘。加樣時，有效載荷在液面下約1 mm加入，并配合緩慢吹吸和傾斜混勻，以提升操作一致性。

轉染后，細胞在37°C、5% CO?條件下培養。檢測環節先使用EVOS進行明場和GFP成像，并保持一致成像參數；隨后使用貝克曼庫爾特 CytoFLEX 流式細胞分析儀進行定量分析。

圖2：代表性的流式細胞術門控策略，從左上角順時針：選擇細胞、選擇單線態細胞、將熒光門應用于陰性對照（僅限培養基）孔和將熒光門用于轉染細胞孔

實驗結果顯示，較高DNA濃度可能影響細胞狀態。在400 ng條件下，無論是定性熒光成像還是定量流式細胞術數據，轉染效率均有所降低。對于Lipofectamine劑量，在多數條件下，0.15 μL和0.3 μL在下游轉染效率方面未觀察到顯著差異，但在50,000個細胞接種密度且加入高DNA濃度的條件下除外。

Echo實驗示例

Echo聲學液體處理系統依靠聲波實現非接觸式液體轉移，單滴基礎體積可為2.5 nL或25 nL，并可通過組合實現納升級至低微升級體積處理。Echo支持自定義源孔、目標孔和轉移體積，適用于多維條件矩陣篩選。

在siRNA轉染優化中，Echo可用于分配轉染脂質與siRNA，建立不同濃度和條件組合的優化矩陣。由于無需吸頭，Echo可減少吸頭消耗，并降低接觸式轉移帶來的交叉污染風險，適用于珍貴siRNA和轉染脂質的微量分配。

圖4：Echo移液系統分配轉染脂質與小干擾RNA（siRNA）的轉染優化矩陣微孔板排布圖，用于測定轉染效率與脂質細胞毒性；轉染實驗操作流程；BT-20細胞轉染PLK1、GL2 siRNA 6天后，在整套轉染優化梯度條件下的細胞活力檢測結果

在相關實驗設計中，PLK1轉染組細胞活力＜20%可作為基因敲低效率良好的判斷標準；GL2對照組細胞活力＞80%則提示轉染試劑毒性較低。

實驗結果顯示，在10株腫瘤細胞中，有9株可以篩選出滿足標準的轉染條件。不同轉染脂質在不同細胞系中的表現存在差異：Lipofectamine RNAiMAX在5株細胞中為較優選擇；HiPerFect在同等濃度下脂質毒性較低，但PLK1敲低殺傷效果相對較弱。對于增殖較慢或蛋白半衰期較長的細胞，6天孵育時間有助于獲得更理想的檢測結果。

在效率方面，Echo完成單塊384孔優化矩陣約需3分鐘，相比手動稀釋移液可明顯縮短多細胞系條件摸索周期。

02 文庫制備與分裝：精準分裝，降低交叉污染風險

siRNA文庫通常樣本珍貴、孔位數量多、對照設置復雜。手工分裝容易出現體積誤差、樣本交叉污染、孔位排布不一致和人工核對負擔增加等問題。對于高通量篩選實驗而言，文庫分裝和對照布局的準確性會直接影響后續篩選流程的執行質量。

Biomek解決方案

貝克曼庫爾特 Biomek i-Series 自動化液體處理工作站 可通過靈活8通道與MC96/384通道移液模塊，完成整塊384孔板siRNA稀釋和分裝。平臺可根據實驗設計自動完成陽性對照、陰性對照和空白對照的標準化排布，減少人工核對和手工排布帶來的誤差。

在文庫分裝過程中，一次性吸頭和防污染設計有助于降低樣本交叉污染風險。對于包含GAPDH/TOX siRNA等陽性對照、非靶向siRNA陰性對照以及空白對照的篩選板，自動化排布可提升板內布局的一致性，便于后續數據分析和結果比較。

03 細胞鋪板與轉染：反向轉染自動化，提升通量與一致性

在高通量siRNA篩選中，細胞鋪板不均、轉染復合物孵育時間不一致以及邊緣效應，都是造成數據偏差的重要因素。尤其在96孔和384孔板中，手工操作帶來的時間差、體積差和孔間差異容易被放大。

Biomek解決方案

Biomek可支持反向轉染全流程自動化。該流程通常先將siRNA-轉染復合物加入孔板，再加入細胞懸液，從而同步完成鋪板與轉染設置。通過大體積多通道移液頭，Biomek可實現整板快速分液，有助于提升細胞鋪板均一性。

在長時間孵育或多板并行實驗中，邊緣孔蒸發會影響孔間一致性。Biomek可自動化添加邊緣孔緩沖液，用于降低蒸發導致的邊緣效應。平臺還可與高通量培養箱等設備整合，支持更連續的細胞處理流程。

通過自動化細胞鋪板、轉染復合物添加和邊緣孔處理，Biomek可幫助研究人員在高通量siRNA篩選中提升流程一致性，并減少重復性手工操作。

04 樣本前處理：無人值守，適配多類型檢測

siRNA篩選后的檢測前處理通常包括細胞染色、裂解、上清收集、樣本稀釋、培養基置換和反應體系分配等步驟。這些操作孔位多、體積小、步驟重復，手工處理容易引入操作差異，并影響后續檢測結果的一致性。

Biomek解決方案

Biomek可通過靈活8通道與MC96/384通道自由切換，適配多種檢測前處理流程，包括CCK-8、熒光染色、裂解液添加、培養基置換和樣本轉移等。平臺可完成小體積染色劑分液、大體積培養基置換等操作，并減少手工處理負擔。

此外，Biomek還可與培養箱、離心機、洗板機等設備整合，支持“移液-孵育-洗滌-收集”等連續自動化流程，為后續檢測輸出更穩定的樣本準備條件。

Echo 525解決方案

Echo 525聲學液體處理系統可用于細胞裂解液直接上樣的一體化自動化RT-qPCR工作流。該流程可減少傳統手工384孔分液中的體積誤差和試劑消耗，適用于基因表達檢測、拷貝數檢測和細胞高通量篩選等應用場景。

圖5：裂解產物無需純化，直接通過Echo聲學移液系統分配至預先配制完成的Luna通用一步法RT-qPCR反應體系中；實驗共設計檢測24個基因的相對表達量；每個基因設置6組生物學重復（對應細胞培養源板不同孔位）、每組設置2次技術重復，總計288組qPCR反應

在相關實驗流程中，細胞先在Echo認證384孔板中培養，隨后使用Luna裂解液在室溫裂解10分鐘。裂解后，上清通過Echo聲學液體處理系統直接轉移至預先配制完成的Luna通用一步法RT-qPCR反應體系中，無需RNA抽提。

該實驗共設計檢測24個基因的相對表達量，每個基因設置6組生物學重復，對應細胞培養源板不同孔位；每組設置2次技術重復，總計288組qPCR反應。

染料法驗證結果顯示，生物學重復與技術重復CV均值＜1.3%，最低豐度基因CV≤2.5%。探針法額外檢測19個靶標時，同樣獲得良好重復性。該流程可用于高通量siRNA敲低篩選和藥物處理后的基因表達批量檢測，并有助于縮短檢測前處理時間。

05 高通量整合與數據追溯：設備對接，實驗流程可記錄

siRNA篩選通常需要對接多類設備，包括液體處理平臺、培養設備、成像系統、酶標儀、PCR儀和qPCR儀等。若依賴人工在不同設備之間切換，容易增加樣本順序、孔位映射和操作記錄出錯的風險。

Biomek解決方案

Biomek支持與多類實驗和檢測設備整合，包括酶標儀、高內涵成像系統、PCR儀和qPCR儀等，可用于構建從篩選到檢測前處理的自動化流程。通過可視化編程軟件，研究人員可根據實驗需求搭建自動化方法，減少復雜流程對人工操作的依賴。

DART全流程數據管理可用于記錄實驗過程中的關鍵操作信息，例如移液體積、樣本ID和流程步驟等。與LIMS系統對接后，可進一步支持樣本信息和實驗流程追溯。對于多板、多批次、多條件的siRNA篩選項目，流程記錄和數據追溯有助于提升實驗管理效率。

總結

siRNA高通量篩選涉及文庫制備、轉染條件優化、細胞鋪板、樣本前處理、檢測準備和數據追溯等多個環節，對移液精度、流程一致性、通量和可追溯性都有較高要求。傳統手工操作在復雜篩選流程中容易引入孔間、板間和批間差異，因此自動化液體處理平臺可為高通量siRNA實驗提供重要流程支持。

貝克曼庫爾特生命科學 Biomek i-Series 自動化液體處理工作站 可用于siRNA文庫分裝、細胞鋪板、反向轉染、樣本前處理和設備整合；Echo 聲學液體處理系統 可用于納升級非接觸式液體轉移、轉染條件優化矩陣和RT-qPCR檢測準備。二者可根據實驗需求應用于siRNA篩選的不同流程環節，支持從條件優化到檢測前處理的自動化執行。

對于功能基因組學研究和RNA干擾相關篩選實驗，自動化平臺可幫助提升實驗流程一致性，減少重復性手工操作，并為多細胞系、多條件和多檢測方式的高通量篩選提供支持。

表1｜siRNA篩選實驗流程與自動化平臺應用

FAQ

1. siRNA高通量篩選為什么需要自動化？

siRNA高通量篩選涉及大量移液、分裝、細胞處理和檢測前準備步驟。自動化平臺可幫助減少手工操作差異，提高板內和板間一致性，并支持多條件、多細胞系篩選流程。

2. Biomek i-Series 在siRNA篩選中主要用于哪些環節？

Biomek i-Series 可用于siRNA文庫分裝、細胞鋪板、反向轉染、試劑添加、染色、裂解、樣本轉移和檢測前處理等任務，適合多步驟、整板化和高通量液體處理流程。

3. Echo聲學液體處理系統適合哪些應用？

Echo適合納升級至低微升級液體轉移，可用于siRNA、轉染脂質和qPCR反應體系等珍貴試劑的微量分配，也適合構建多維條件矩陣進行轉染優化。

4. siRNA轉染優化為什么需要多條件矩陣？

siRNA轉染效果與細胞類型、細胞密度、siRNA濃度、轉染試劑類型和用量、孵育時間等因素相關。多條件矩陣有助于系統比較不同組合條件下的實驗表現。

5. Echo 525用于RT-qPCR檢測準備有什么特點？

Echo 525可將細胞裂解上清直接轉移至qPCR反應板，減少傳統手工384孔分液帶來的體積差異，并可用于高通量基因表達檢測和siRNA敲低篩選后的檢測準備。

6. 自動化siRNA篩選如何支持數據追溯？

自動化系統可記錄樣本ID、移液體積和流程步驟，并可與數據管理系統或LIMS對接，支持多板、多批次和多條件實驗的流程追溯。

參考文獻

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