Beutler改良法測定組織GSH操作規程

• 原理及意義

原理：DTNB能被-SH基團還原，產生等克分子的2-硝基-5-巰基苯甲酸，而苯甲酸陰離子在一定PH值條件下呈黃色，在412 nm波長下有吸收峰。

意義：還原型谷胱甘肽（glutathione, GSH）是一種低分子自由基清除劑，它可清除O₂˙ 、H₂O₂、LOOH。GSH是蛋氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的一種小分子肽，是組織中主要的非蛋白質的巰基化合物，并且是谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）和谷胱甘肽硫轉移酶（GST）兩種酶類的底物，為這二種酶分解氫過氧化物所必需，能穩定含巰基的酶和防止血紅蛋白及其它輔因子受氧化損傷，zui近還證明GSH也參與使Vit E恢復到還原態的作用。GSH測定值的高低可間接反映機體發生氧化損傷的程度。

• 器材

可見光分光計、7 ml離心管和管架、加樣器和槍頭

• 試劑

① 1 mmol/L的GSH（標準品）；

② 1％檸檬酸鈉；

③ 二硫雙基苯甲酸（dithio-bis-nitrobenzoicacid, DTNB）試劑：用1％檸檬酸鈉配成終濃度0.04％（w/v）；

④ 20％三氯醋酸；

⑤ 0.3 mol/L磷酸氫二鈉（Na₂HPO₄）緩沖液。

• 步驟

1、樣品處理及試驗步驟（下面以肝臟組織為例）

稱取一定量的肝臟組織于冰冷0.85％生理鹽水中漂洗，濾紙吸干表面水分，燒杯內剪碎     制備20%組織勻漿液（須用0.85％生理鹽水或三蒸水）    4000 g離心10 min后取上清液      按上清液:20％三氯醋酸（體積比）為2:1混合（加TCA前留取20 μl上清液用于Lowry法測蛋白）     混勻，4000 g離心10 min（此步離心要充分，可適當提高離心力）     收集上清液按表2測定。

2、按下表1繪制標準曲線（單位：ml）

表1 GSH標準曲線的測定

混勻，5 min內于412nm比色，以三蒸水調零，以標準GSH濃度為X軸，相應吸光值為Y軸，繪制標準曲線，并求回歸方程。

3、按下表2操作測定樣品GSH（單位：ml）

表2  Beutler改良法樣品測定操作

測得的吸光值代入回歸方程，可計算出樣品液的GSH濃度。

• 實驗結果

1、標準曲線結果

根據上數據測得標準曲線方程為：

X(μmol)=0.3744898 Y+0.0017227（其中Y為吸光值，標準曲線看Figure 1）

Figure 1  GSH標準曲線圖

• 注意事項

• 樣品應冰上勻漿，所有步驟盡量保證低溫下操作，否則結果偏低；
• 所有用水均需三蒸水，否則結果偏低；
• 未經蛋白變性處理的樣品在－20℃不宜存放；
• 反應管內zui終PH值必須保證在8.0～9.0間，否則結果不穩定；
• 配好的DTNB應在有限期內使用（4℃下可存1個月）；
• GSH濃度低時顯色快，消退也快；濃度高時顯色慢，消退也慢，一般反應1～5 min后測定（不要超過5 min）；
• 反應總體積可調為2.5 ml。