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本期我們邀請到的是中國食品發酵工業研究院有限公司高紅波老師

背景介紹：
2,4,6-三氯苯甲醚（TCA）
是霉菌代謝含有三氯苯酚等一系列含氯的化合物經過復雜的反應后產生的化學副產物^[1]，一般認為高于10 ng/L超痕量TCA就會對葡萄酒的風味和品質產生影響，使葡萄酒產生一種類似潮濕地下室或濕報紙的霉味^[2]。TCA是非常穩定的化合物,灌瓶后滲透到葡萄酒中的TCA比葡萄酒本身更穩定^[3]。每年給葡萄酒工業帶來巨大的經濟損失。
由于這種污染主要是由封裝葡萄酒的軟木塞引起的，橡木塞由于其特殊的性能又很難用其他的螺旋塞等代替，因此建立一套能對葡萄酒和軟木塞中TCA進行檢測與分析定量的既精.確又高效的方法就愈發的重要，從而對葡萄酒在生產和儲藏過程中的每一個環節進行有效地質量控制，達到控制污染水平的目的。

分析方法簡介
樣品前處理技術是葡萄酒和軟木塞中TCA檢測的關鍵，目前國內外軟木塞中TCA的方法主要是固相萃取（SPE）、固相微萃取（SPME）、離子遷移譜等^[4-10]。
 本文對固相微萃取技術測定TCA樣品前處理條件進行研究,并通過方法學評價，建立了固相微萃取-GC-ECD法測定軟木塞及葡萄酒中超痕量TCA的方法，并開展了不同類型葡萄酒用軟木塞和葡萄酒中TCA含量的測定，為葡萄酒企業開展葡萄酒用軟木塞的測定提供有效途徑。

1材料與方法
1.1儀器與試劑
氣相色譜儀；
固相萃取頭：涂層厚為100 µm的聚二甲硅烷氧烷纖維頭（PDMS）。
乙醇（色譜純）；
2,4,6-三氯苯甲醚；
2,4-二氯苯甲醚（DCA）
氯化鈉（分析純）
葡萄酒樣品（廠家提供），
1.2實驗方法
1.2.1葡萄酒樣品測定

50. 取5mL葡萄酒樣品于20ml頂空瓶中，
50. 加入1.5 gNaCI，100μL 50μ/L的DCA標準液，壓蓋，進樣。

1.2.2軟木塞處理 

50. 取10~15 個軟塞子于 500 mL試劑瓶，
50. 加入300 mL12 %乙醇水溶液，使塞子*浸沒，浸泡24 h±2 h。取 5 mL 浸泡液于 20 mL 頂空瓶中，以下步驟同1.2.1。

1.2.3 萃取及色譜條件
   固相微萃取條件：

50. 將頂空瓶置于恒溫加熱磁力攪拌器中，40℃平衡10min，
50. 將固相微萃取頭插入頂空瓶，在40℃持續攪拌下萃取30min，
50. 然后在氣相色譜進樣口260℃解析時間：5 min。

氣相色譜條件：

50. 色譜柱：HP-5毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）或等效色譜柱；
50. 柱溫：初溫50℃，保持2 min，以9.0℃/min升到150℃，保持1 min，以20℃/min升到260℃，保持3 min；
50. 進樣口溫度：260℃；
50. 電子捕獲檢測器溫度：330℃；
50. 載氣流量：1.0 mL/min；
50. 進樣方式：不分流進樣；

2 結果與討論
2.1  固相微萃取條件的優化
2.1.1  NaCI添加量的選擇
無機鹽NaCl的添加量對TCA的萃取效果具有重要影響。在溶液中加入NaCl，溶液的粒子強度增加，使有機分析物的非極性相對增強并使其在水溶液中的溶解度下降，萃取量得到增加，同時NaCl的加入還會影響基質粘度，降低分析物的擴散速度，產生鹽的負效應。
本實驗選擇5mL樣品，萃取溫度40℃，對NaCl的加入量進行優化,發現隨著NaCl量增加，TCA和DCA峰面積逐漸升高然后降低,當加入1gNaCl時兩者峰面積達到大,結果見圖1 因此選擇加入1.5gNaCl。


圖1 NaCl的添加量對萃取效果的影響
2.1.2 萃取溫度的選擇
萃取溫度對萃取效果的影響具有兩面性：一方面，溫度升高有利于有機組分從液體擴散到頂空部分
另一方面，溫度升高又會使有機組分在吸附填料與樣品中的分配系數降低，從而降低對被分析組分的吸附量。本文固定其它條件對吸附溫度進行優化，由圖2可見，吸附溫度升高時吸附量有所增加，當溫度由40℃提高到50℃時峰面積有所降低，所以選擇40℃作為吸附溫度。

圖2 萃取溫度對萃取效果的影響

2.1.3 萃取時間的優化
SPME萃取時間對待測組分的萃取效果有較大的影響，固定萃取溫度及溶液離子強度等其它條件不變，對不同萃取時間進行比較。取40ppt的TCA標準溶液加入1.5g氯化鈉， 100µl 工作液(2.0ppt) 分別萃取10min 、20min 、30min 、40min(樣品平衡時間均為5min)進行比較。由圖3可見，吸附時間加長時TCA吸附量有所增加，當萃取時間到30min時峰面積平穩，所以選擇30min作為萃取時間。
固相微萃取-氣相色譜法測定軟木塞及葡萄酒中超痕量2,4,6-三氯苯甲醚

圖3 萃取時間對萃取效果的影響

2.2  測定條件優化
  采用程序升溫對TCA色譜測定條件進行了優化，DCA及TCA與樣品基質的干擾組分得到良好的分離見圖1

                             圖1 TCA標準品及樣品譜圖
2.3 方法學評價
2.3.1 線性范圍及檢出限
分別配制2.0ng/L～50 ng/L 5個不同質量濃度的TCA種標準溶液，按上述確定的實驗條件進行測定，質量濃度為橫坐標，以TCA峰面積與DCA峰面積之比為縱坐標、繪制出測定曲線，線性回歸方程y=18.947x，相關系數R² =0.9989,信噪比大于10時,定量下限為0.60 ng/L。
2.3.2回收率的測定
在軟木塞浸泡液及葡萄酒中加入不同濃度的TCA標準溶液，按照實驗方法測定計算方法回收率，結果如表2，TCA的回收率在80.0%～113.75%之間，說明說明該法具有很好可靠性和準.確性。
表1 方法的加標回收率

2.3.3重復性測定
   取同一樣品6份按照實驗方法進行測定TCA含量，計算方法相對標準偏差，結果見表2，方法的重復性小于10%，說明此方法可靠，數據準確。
表2  方法重復性測定

2.4 樣品中TCA的測定
按照實驗方法對本次測試3種個不同類型的橡木塞及7個葡萄酒樣品，標品及樣品的譜圖樣品結果如下表3：
表3   軟木塞及葡萄酒中TCA檢測結果 (ng/L)

注：ND表示未檢測出
這3種木塞類型代表了國內葡萄酒高中低當葡萄酒的封裝材料，由上表可以看出測試的原木塞沒有檢測出TCA，生產原木的原料控制的很好，原木經過消毒加工過程中也沒有受到很多污染。1+1貼片塞檢出了TCA，與 遭受污染跟使用的粘合劑，加工方式，以及碎木屑的種類以碎木屑的衛生狀況有關；檢測的7種葡萄酒中有4種檢測出TCA，說明我國葡萄酒存在一定量的TCA污染。

3 結 論
建立了固相微萃取-氣相色譜法測定軟木塞及葡萄酒中超痕量2,4,6-三氯苯甲醚（TCA）的分析方法。對萃取溫度、鹽濃度及萃取時間等條件進行了優化。確定.佳條件：5ml樣品，加入1.5g 氯化鈉，萃取溫度為40℃，40℃平衡10min，萃取時間30min。待測組分經過萃取富集后，氣相色譜-電子捕獲檢測器檢測，內標法進行定量。該方法在2.0～50.0ng/L范圍內線性良好，定量限為0.6ng/L，回收率在 80.0 %113.75 %之間，相對標準偏差（n=5）小于10.0%，滿足葡萄酒及軟木塞中超痕量TCA測定的需要。

參考文獻
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