GB/T 23527.2-2025 酶制劑質量要求 第2部分：脂肪酶制劑

范圍
本文件給出了脂肪酶制劑的產品分類，規定了技術要求、檢驗規則、標志、包裝、運輸和貯存，并描述了相應的試驗方法。
本文件適用于微生物發酵生產的脂肪酶制劑產品的生產、檢驗和銷售。

術語和定義
下列術語和定義適用于本文件。
脂肪酶  lipase
能水解甘油三酯(含天然油脂)或脂肪酸酯產生單或雙甘油酯或甘油和游離脂肪酸，在特定條件下也能催化酯合成和酯交換反應的酶。
脂肪酶制劑  lipase preparations
以脂肪酶為主要催化活性組分，通過制劑等工藝制得的產品。
注：制劑工藝中能加入有助于產品貯存、穩定和使用的輔料。
脂肪酶活力  lipase activity
脂肪酶制劑的酶活力  activity of lipase preparations
1g固體脂肪酶制劑(或1mL液體脂肪酶制劑)含有的酶活力單位。
注1：以U/g(或U/mL)表示。
注2：在一定溫度和pH條件下，脂肪酶每分鐘水解底物產生1μmol的可滴定的脂肪酸，即為脂肪酶1個酶活力單位(以U表示)。也能根據所采用的酶活力測定方法，另行約定相應的酶活力單位。

產品分類
按產品的應用領域
食品工業用和其他工業用脂肪酶制劑。
按產品的形態
固體劑型(含粉末劑型、顆粒劑型和固定化劑型)和液體劑型脂肪酶制劑。

要求
感官要求
應符合表1的規定。


理化要求
應符合表2的規定。


試驗方法
酶活力
根據底物適應性，測定水解橄欖油底物的酶活力時，按附錄A進行檢測；測定水解三丁酸甘油酯底物的酶活力時，可參考附錄B。也可根據實際需求采用其他方法進行檢測。

附錄A  (規范性)
脂肪酶制劑活力的測定滴定法
A.1 原理
脂肪酶在一定條件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油單酯和甘油，所釋放的脂肪酸可用標準堿溶液進行中和滴定，用pH計指示反應終點，根據消耗的堿量，計算其酶活力。
反應式為：

A.2 試劑和材料
A.2.1 聚乙烯醇：聚合度1750±50。
A.2.2 橄欖油：試驗試劑。
A.2.3 無水乙醇。
A.2.4 磷酸二氫鉀。
A.2.5 十二水磷酸氫二鈉。
A.2.6 NaOH。
A.3 溶液配制
A.3.1 聚乙烯醇溶液(4%)：稱取聚乙烯醇40g(精確至0.1g)，加水800mL，在沸水浴中加熱，攪拌，直至全部溶解，冷卻定容至1000mL。
注：根據乳化效果和溶解情況，也能選擇使用2％的聚乙烯醇溶液。
A.3.2 底物溶液：稱量聚乙烯醇溶液150g， 加橄欖油50g，用高速勻漿機10000r/min處理6min(分2次處理，間隔5min，每次處理3min)，水浴控制溫度，處理過程中溫度維持在60°C，處理結束后常溫下磁力攪拌20min。底物溶液顯微鏡觀察應有80％以上的液滴直徑小于或等于3μm。該溶液現配現用。
注：也能選其他轉速，并根據乳化效果延長或縮短均質時間。
A.3.3 磷酸緩沖溶液(pH=7.5)：分別稱取磷酸二氫鉀1.96g和十二水磷酸氫二鈉39.62g，用水溶解并定容至500mL。如需要，調節溶液的pH至7.5±0.05。
A.3.4 NaoH標準溶液[c(NaOH)=0.05mol/L上按 GB/T 601 的規定配制與標定0.5mol/L NaOH標準滴定溶液。使用時，準確稀釋10倍。
注：也能采用商品化的NaOH標準溶液。
A.3.5 乙醇溶液(95%，體積分數)。
A.3.6 酚酞指示液(10g/L)：按 GB/T 603 的規定配制。
A.4 儀器和設備
A.4.1 磁力攪拌水浴鍋：±0.2°C。
A.4.2 電子天平：感量0.1mg。
A.4.3 移液器。
A.4.4 酸度計：精度±0.01。
A.4.5 秒表。
A.4.6 高速勻漿機。
A.4.7 電位滴定儀。
A.4.8 光學顯微鏡。
A.4.9 微量滴定管：10mL，分刻度≤0.05mL。
A.5 分析步驟
A.5.1 樣品前處理
稱取酶樣品1.00g(精確至0.1mg)或1.0mL，加入適量磷酸緩沖溶液磁力攪拌溶解15min并稀釋，稀釋酶液采用玻璃器皿，測定時控制酶液濃度，樣品與對照消耗堿量之差控制在1.0mL~2.0mL范圍內，吸取樣品時，應將酶液搖勻后再取。
注：酶會附著在塑料上，因此用玻璃器皿溶解稀釋和滴定。使用塑料槍頭短時間轉移的情況除外。
A.5.2 測定
A.5.2.1 電位滴定法(仲裁法)
按電位滴定儀使用說明書對儀器進行校正(若使用酸度計進行試驗， 則按照酸度計說明書對酸度計進行校正)。
取4個100mL燒杯，于空白杯(A)和樣品杯(B1、B2、B3)中各加入4.0mL底物溶液，5.0mL磷酸緩沖溶液，再于A杯中加入15.00mL 95％乙醇溶液。40°C±0.2°C水浴中磁力攪拌預熱5min，然后于空白杯(A)和樣品杯(B1、B2、B3)中各加1.00mL待測酶液，準確反應15min后，于樣品杯(B1、B2、B3)中立即補加15.00mL 95％乙醇溶液終止反應。
在每個燒杯中加25mL蒸餾水，置于電位滴定儀上(若使用酸度計，則將酸度計電極放入燒杯中)，邊攪拌，邊用NOH標準溶液滴定，直至pH10.3為滴定終點，記錄消耗NOH標準溶液的體積。
注：對于某些脂肪酶樣品加入25mL蒸餾水影響酶活檢測結果，此類樣品在終止反應后直接進行NaOH標準溶液滴定。
A.5.2.2 指示劑滴定法
取2個100mL錐形瓶，分別于空白瓶(A)和樣品瓶(B)中各加入底物溶液4.00mL和磷酸緩沖液5.00mL，再于A瓶中加入95％乙醇溶液15.00mL，于40°C±0.2°C水浴中預熱5min，然后于空白瓶(A)、樣品瓶(B)中各加待測酶液1.00mL，立即混勻計時，準確反應15min后，于樣品瓶(B)中立即補加95％乙醇溶液15.0mL終止反應，取出。
于空白和樣品溶液中各加酚酞指示液兩滴，用NOH標準溶液滴定，直至微紅色并保持30s不褪色為滴定終點，記錄消耗NaoH標準溶液的體積。
A.6 計算
脂肪酶制劑的酶活力按公式(A .1)計算：

式中：
X₁——樣品的酶活力，單位為酶活力單位每克或酶活力單位每毫升(U/g或U/mL)；
V₁——滴定樣品溶液時消耗NaOH標準溶液的體積，單位為毫升(mL)；
V₂——滴定空白溶液時消耗NaoH標準溶液的體積，單位為毫升(mL)；
c ——NaOH標準溶液濃度，單位為摩爾每升(mol/L)；
50——0.05mol/L NaOH溶液1.00mL相當于脂肪酸50μmol；
n₁——樣品的稀釋倍數；
0.05——NaOH標準溶液濃度換算系數；
15——反應時間15min。
A.7 結果表示
所得結果表示至整數。
A.8 精密度
在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的差值應不超過算術平均值的10%。

附錄B  (資料性)
脂肪酶制劑活力的測定動態滴定法
B.1 方法信息
B.1.1 原理
脂肪酶水解甘油三酯生成脂肪酸，使反應體系的pH下降。通過連續加入堿的方法保持反應體系的pH恒定。堿滴定的速率與酶活力成比例。酯酶的存在會使檢測的脂肪酶的活力增加。蛋白酶的存在降解脂肪酶，從而使檢測到的脂肪酶的活力減小。
注：洗滌劑的存在會嚴重影響本方法。依不同洗滌劑的類型和濃度不同，這種影響表現為從抑制到激活。酶會附著在塑料上，因此用玻璃器皿溶解稀釋和滴定，使用塑料槍頭短時間轉移的情況除外。
B.1.2 反應式
反應式為：

B.1.3 反應條件
反應條件如下：
——溫度：30°C±1°C；
——pH：7.00；
——底物濃度：0.16mol/L的三丁酸甘油酯；
——反應時間：至少1.5min(只有線性反應區用于計算斜率)。
B.1.4 分析范圍
樣品的分析范圍為0.2U/mL~4.0U/mL。如果可能，所有樣品在1.5U/mL~4.0U/mL的范圍內被分析。
B.1.5 檢測限
對于液體樣品，檢測限為20U/g，相當于2.5g樣品溶解在10mL溶液中，然后再稀釋25倍。對于固體樣品，檢測限為50U/g，相當于1.0g樣品溶解在10mL溶液中，然后再稀釋25倍。
B.2 儀器和設備
B.2.1 動態滴定(pH-stat)功能的滴定儀。
B.2.2 乳化器。
B.2.3 恒溫水浴：精度±0.2°C。
B.2.4 溫度計：精度±0.2°C。
B.2.5 自動移液器。
B.3 試劑
除非另有說明，在分析中僅使用確認為分析純的試劑和蒸餾水或去離子水或相當純度的水。
B.3.1 三丁酸甘油酯(C₁₅H₂₆O₆)。
B.3.2 氯化鈉(NaCl)。
B.3.3 磷酸二氫鉀(KH₂PO₄)。
B.3.4 阿拉伯膠。
B.3.5 甘氨酸(H₂NCH₂COOH)。
B.3.6 甘油[HOCH₂CHCOH)CH₂OH]。
B.3.7 NaOH片劑(NaOH)。
B.3.8 電極校正液(pH7.0)。
B.3.9 電極校正液(pH4.01)。
B.3.10 乙醇溶液(96%，體積分數)。
B.3.11 氮氣(N₂)。
B.3.12 NaOH溶液[c(NaOH)=1mol/L]：按照 GB/T 601 的規定配制。
B.3.13 NaOH滴定液[c(NaOH)=0.025mol/L]：取NaOH溶液25mL，用水稀釋并定容至1000mL。配好后需用適宜的設備脫氣。
B.3.14 NaOH滴定液[c(NaOH)=0.005mol/L上取NaOH滴定液25mL，用水稀釋并定容至5000mL。
B.3.15 乳化劑：移取約180mL去離子水于500mL燒杯中，加入攪拌子高速攪拌，再緩慢加入30.0g阿拉伯膠，繼續攪拌至全部溶解。另取500mL燒杯，加入53.7g氯化鈉和1.20g磷酸二氫鉀，再加入350mL水充分溶解。將1620mL甘油置于3L容量瓶中，再依次加入上述氯化鈉-磷酸二氫鉀溶液和阿拉伯膠溶液，最后以水定容并混勻。
B.3.16 底物乳劑：稱取三丁酸甘油酯62.5g，分別量取乳化劑200mL和水940mL，混合。將混合液用勻漿器處理3min(7000r/min)。勻漿后的溶液先用普通的磁力攪拌器攪拌至少20min，然后調節pH至4.75±0.05。
注：不同來源和批號的三丁酸甘油酯和阿拉伯膠對試驗結果有影響，在更換產品或批號前需進行有效性確認。
B.3.17 甘氨酸緩沖液1(7.51g/L)：稱取甘氨酸37.54g和NaOH片劑18.5g，用水溶解并定容至5L。如需要，調節溶液的pH至10.8±0.05。
B.3.18 甘氨酸緩沖液2(0.75g/L)：取100mL甘氨酸緩沖液1，用水定容至1000mL。如需要，調節溶液的pH至10.8±0.05。
B.4 標準曲線和樣品處理
B.4.1 標準曲線
稱取一定量的已知活力酶標準品，精確至0.0001g，用甘氨酸緩沖液2溶解并稀釋，制成標準儲備液。標準儲備液的濃度為20U/mL。然后按照表B.1配制溶液，并繪制標準曲線。

B.4.2 標準對照
可使用已知活力的樣品作為標準對照。標準對照的處理同樣品。
B.4.3 樣品處理
不同的樣品需做不同的預處理，以激活或保護在樣品基質中的脂肪酶。
可考慮采用甘氨酸緩沖液1和水來分別溶解和稀釋樣品的方法，或采用甘氨酸緩沖液2來溶解和稀釋樣品的方法，或直接用水溶解和稀釋樣品的方法，以求得到效果。樣品的溶解液和稀釋液需攪拌均勻。樣品最終稀釋到酶活力在1.5U/mL~ 4.0U/mL范圍內。如可能，樣品稀釋完立即測定。
B.5 分析步驟
B.5.1 系統準備
B.5.1.1 按照無水乙醇、適當的肥皂水、熱水、去離子水、底物的順序清洗滴定容器和管路。保證水浴的溫度在30.0°C±0.5°C。
B.5.1.2 校正pH電極：使用前需校正pH電極的靈敏度在95%~102%；pH7.00在6.985~6.989之間；pH4.01在4.009~4.012之間。如果達不到此標準，按照pH電極使用說明進行沖洗并再次校正。
B.5.2 分析
B.5.2.1 pH 電極用后浸泡在飽和的KCl溶液中，使用前沖洗。在反應溶液表面用氮氣吹充，以防止空氣中二氧化碳的干擾。分析前一定要保證底物的溫度為30.0°C±0.5°C。在分析每個樣品前要用0.005mol/L的NaOH滴定液沖洗滴定皿和管路。
B.5.2.2 試驗步驟如下。
——將15mL的底物加入滴定皿中。滴定前pH電極的讀數應小于7.0。
——加1mL樣品稀釋液加入滴定皿中。反應體系的pH在滴定過程中保持在7.0。記錄為保持恒定pH而加入的滴定液的量。
——滴定結束后滴定儀打印出滴定曲線線性范圍的平均斜率(如果使用不同的設備，數據可能以其他形式輸出)。滴定曲線需有一段持續1.5min的線性輸出。
——先分析標準曲線(每個標準點分析一次)，再分析一個標準對照，最后分析樣品(每個樣品分析一次)。需注意， 一天內非一次運行的樣品不能使用相同的標準曲線。如果樣品在當天晚些時候分析，標準溶液要重新分析。
——每個樣品分析前和后一個樣品完成分析后，系統將進行沖洗。排空底物容器和管路，并用乙醇沖洗。如果系統將在一周以上時間不再使用，則需用去離子水進行沖洗并用NaOH滴定液或相同濃度的鹽酸溶液充滿敏感部件，避免出現鹽類結晶。
B.6 計算
B.6.1 結果計算
利用標準點的測定值作標準曲線，其中X軸為標準品酶活力，Y軸為相應的滴定反應的平均斜率(mL/min)。標準曲線為一條直線。樣品稀釋液的活力從標準曲線中讀出，然后按公式(B.1)計算：

式中：
X₂——樣品的酶活力，單位為酶活力單位每克(U/g)或酶活力單位每毫升(U/mL)；
A ——稀釋樣品在標準曲線上讀出的酶活力，單位為酶活力單位每毫升(U/mL)；
V₃——樣品溶解用的容量瓶體積，單位為毫升(mL)；
n₂——第二次稀釋的倍數；
m₃——樣品的質量或體積，單位為克(g)或毫升(mL)。
B.6.2 結果的確認
當滿足以下條件時可以確認本次分析有效。
a) 標準對照的檢測值在本方法所規定的可接受偏差范圍內。
b) 標準曲線的斜率滿足：
1) 標準點1小于0.02mL/min；
2) 標準點6在0.14mL/min~0.18mL/min之間。
c) 標準曲線的相關系數(r²)大于或等于0.995。
d) 標準點3～點6相關系數(r²)大于0.9995。標準點1～點2的r²大于0.995是可接受的。如果達不到此條件，檢查分析系統。
B.6.3 結果的表示
結果給出3位有效數字。如果結果低于檢測限，則表示為小于20U/g(液體)或小于50U/g(固體)。
B.7 精密度
在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的差值應不超過算術平均值的5%。


京都電子KEM 電位滴定儀&動態滴定(pH-stat)功能的滴定儀 AT-710S