相差顯微鏡是能將光通過物體時產生的相位差（或光程差）轉變為振幅（光強度）變化的顯微鏡。主要用于觀察活細胞、不染色的組織切片或缺少反差的染色標本。
人眼只能鑒別可見光的波長（顏色）和振幅的變化，不能鑒別相位的變化。而大多數生物標本高度透明，光波通過后振幅基本不變，僅存在相位的變化。相差顯微鏡基本把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。光線透過標本后發生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了1/4λ（波長），如果再增加或減少1/4λ，則光程差變為1/2λ，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減下，提高反差。
從結構上看，相差顯微鏡與普通光學顯微鏡不同之處在于：
1．環形光闌
具有環形開孔的光闌，安裝在光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，聚焦到標本上。
2．相位板
相差顯微鏡在物鏡內部增加了涂有氟化鎂的相位板，作用是將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。相板上有兩個區域，直射光通過的部分叫“共軛面”，衍射光通過的部分叫“補償面”。相位板按工作效果分為兩種類型：
（1）A+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波疊加，振幅加大，標本結構比周圍介質更加明亮，形成亮反差（或稱負反差）。
（2）B+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，標本結構比周圍介質更加暗淡，形成暗反差（或稱正反差）。
帶有相板的物鏡叫相差物鏡，常在物鏡外殼上標以“Ph”字樣。
3．合軸調節望遠鏡
相差顯微鏡配備有一個合軸調節望遠鏡（在外殼上標有“CT”符號），用于調節環狀光闌的像與相板共軛面吻合，以便實現對直射光和衍射光的特殊處理。使用時撥去一側目鏡，插入合軸調節望遠鏡，調節合軸調節望遠鏡的焦點，視野中會呈現兩個圓環，分別是明亮的環狀光闌圓環與較暗的相板上共軛面圓環。再轉動聚光器上的環狀光闌的兩個調節螺旋，使兩環重疊。如明亮的光環過小或過大，可調節聚光器的升降旋鈕，使兩環吻合。如果聚光器已升到點或降到點而仍不能矯正，說明玻片太厚了，應更換。調好后即可取下合軸調節望遠鏡，換回目鏡。
4．綠色濾光片
用于調整光源的波長。照明光線的波長不同，會引起相位的變化，為了獲得良好的相差效果，相差顯微鏡要求使用波長范圍比較窄的單色光，通常是用綠色濾光片來調整。
相差顯微鏡的使用步驟如下：
① 根據待檢標本的性質及要求，挑選適合的相差物鏡。
② 將標本玻片放到載物臺上，進行光軸中心的調整。
③ 使用合軸調節望遠鏡，調整環狀光闌與相板上的共軛面圓環重疊吻合后，換回目鏡。在觀察過程中，每次更換物鏡倍數時，必須重新進行環狀光闌與相板共軛面圓環吻合的調整。
④ 加綠色濾光片，按普通光學顯微鏡的操作步驟進行觀察。