MabSelect 系列 Protein A 親和樹脂單克隆抗體捕獲純化工藝優化研究

時間：2026/6/23閱讀：292

摘要

針對治療性單克隆抗體下游純化捕獲環節存在載量低、填料循環壽命短、宿主雜質去除效果差等問題，以 Cytiva MabSelect 全系列 Protein A 樹脂為研究對象，系統對比 MabSelect、MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX、MabSelect PrismA 四種介質的基質結構、動態結合載量、耐堿清洗能力與雜質清除性能。以 CHO 細胞表達 IgG1 型單抗發酵上清為原料，構建平衡 - 多級洗滌 - 酸性洗脫 - 酸洗剝離 - 在位清洗（CIP）標準化層析工藝，通過單因素試驗優化上樣 pH、洗脫 pH、洗滌鹽濃度、CIP 堿濃度等關鍵工藝參數。結果顯示：MabSelect PrismA 綜合性能，6 min 停留時間下動態載量可達 80 mg IgG/mL 樹脂，最高耐受 1.0 mol/L NaOH 在位清洗，穩定循環 200 次以上；優化后的兩級梯度洗滌體系可去除 93% 以上宿主蛋白（HCP），單抗總回收率≥90%，洗脫單體純度＞95%，宿主 DNA 殘留＜10 pg/mg，Protein A 配基泄漏＜5 ng/mg 抗體。該套工藝適配實驗室小試、中試放大與商業化生產線，可用于完整 IgG、Fc 融合蛋白、雙特異性抗體純化，為抗體藥物下游捕獲平臺工藝開發提供標準化技術方案。

0 引言

單克隆抗體藥物是腫瘤、自身免疫性疾病臨床治療的核心生物制劑，完整下游純化流程分為親和捕獲、精細層析純化、制劑緩沖液置換三大單元，其中 Protein A 親和層析承擔絕大部分宿主雜質去除工作，是決定產品純度、生產成本的關鍵步驟。傳統天然 Protein A 瓊脂糖基質機械強度弱、耐堿性差、配基易水解脫落，動態載量偏低，僅能短期循環使用，難以適配高滴度補料發酵液大規模連續生產。

Cytiva 開發的 MabSelect 系列重組 Protein A 樹脂采用無動物源穩定配基與高交聯剛性瓊脂糖骨架，形成四代梯度產品矩陣，分別適配基礎科研、臨床前中試、商業化大規模生產等不同應用場景。現有研究多針對單一型號樹脂開展工藝摸索，缺少全系列樹脂橫向性能對比，同時缺少統一、可線性放大的標準化緩沖體系與分級 CIP 清洗方案。

本文系統表征 MabSelect 系列樹脂理化與層析性能，建立通用緩沖液體系，系統優化關鍵工藝參數，評估填料循環穩定性與雜質去除能力，形成一套合規、低成本、可直接放大的單抗捕獲工藝，為創新抗體藥物下游工藝開發與申報提供完整數據支撐。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

層析介質：MabSelect、MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX、MabSelect PrismA（Cytiva 原裝 50% 乙醇保護漿液）；HiTrap 5 mL 預裝柱、Tricorn 5/50 層析柱。

樣品：CHO 細胞補料發酵上清，人源 IgG1 單抗，滴度 2.8 g/L，0.22 μm 水系濾膜過濾后備用。

試劑：磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、醋酸鈉、Tris、NaCl、冰醋酸、CHAPS（色譜純）；HCP ELISA 檢測試劑盒、宿主 DNA 熒光定量試劑盒、CE-SDS 毛細管電泳試劑、蛋白定量試劑盒。

耗材：0.22 μm 濾器、50 mL 無金屬離心管、NanoTemper 檢測毛細管。

1.2 儀器設備

?KTA avant 25 全自動蛋白純化系統；NanoDrop 紫外分光光度計；高速冷凍離心機；pH 計、電導率儀；毛細管電泳儀；熒光定量 PCR 儀；動態光散射粒度儀。

2 實驗方法

2.1 樹脂基礎性能表征

1）動態結合載量測定：各型號樹脂裝填 1 mL Tricorn 層析柱，平衡緩沖液充分平衡，設置 2.4 min、4 min、6 min 三組停留時間上樣發酵上清，實時監測 UV280 吸收曲線，以 10% 抗體穿透點計算 QB10 動態載量。

2）耐堿循環穩定性測試：每次層析結束后采用不同濃度 NaOH 反向沖洗柱床 10 min，連續循環 150 次，每 30 次取樣測定動態載量、Protein A 配基泄漏量，評價填料性能衰減程度。

3）配基泄漏檢測：收集全部洗脫組分，雙抗夾心 ELISA 法定量游離 Protein A 含量。

2.2 標準化層析緩沖液配方

1）平衡緩沖液：20 mM NaPi，150 mM NaCl，pH 7.4；

2）高鹽洗滌緩沖液：20 mM NaPi，500 mM NaCl，pH 7.0；

3）弱酸預洗緩沖液：50 mM 醋酸鈉，pH 6.0；

4）洗脫緩沖液：50 mM 醋酸鈉，pH 3.5；

5）中和緩沖液：1 mol/L Tris-HCl pH 8.0（洗脫收集管預先添加，體積占洗脫液 5%）；

6）酸洗剝離液：100 mM 醋酸，pH 2.9；

7）分級 CIP 再生液：0.1 mol/L、0.5 mol/L、1.0 mol/L NaOH；

8）填料保存液：20% 乙醇 - PBS 無菌溶液。

2.3 標準層析操作流程

柱床體積 1 mL，流速 180 cm/h，停留時間 6 min；上樣量控制為樹脂動態載量 75%；完整流程：3 倍柱體積（CV）平衡→上樣→5 CV 高鹽洗滌→1 CV 弱酸預洗→3 CV 酸性洗脫→2 CV 酸洗剝離→3 CV CIP 堿液循環清洗→純水中和→平衡保存。

2.4 單因素工藝優化試驗

以單抗回收率、HCP 殘留、抗體單體純度為評價指標，分別考察上樣 pH（6.8、7.2、7.4、7.8）、洗脫 pH（3.2、3.5、3.8、4.2）、洗滌 NaCl 濃度（150、300、500、800 mM）、CIP 堿濃度對純化效果的影響。

2.5 產品質量檢測方法

抗體濃度采用 UV280 定量，消光系數 E1%=13.7；HCP 采用 ELISA 試劑盒定量；宿主 DNA 采用 qPCR 檢測；抗體純度、單體比例采用 CE-SDS 分析；蛋白聚集采用動態光散射與 nanoDSF 聯合檢測；Protein A 泄漏采用 ELISA 定量。

3 結果與分析

3.1 MabSelect 系列樹脂基礎性能對比

四種樹脂均采用高交聯球形瓊脂糖基質，配基為環氧偶聯重組 Protein A，僅孔徑、配基修飾、耐堿改造存在差異，關鍵性能見表 1。

表 1 MabSelect 系列樹脂核心層析性能

表格

樹脂型號	平均粒徑 /μm	6 min 停留 QB10 載量 /(mg?mL?1)	最高耐受 NaOH 濃度	推薦循環次數	適用場景
MabSelect	90	45~50	0.1 mol/L	50~80	實驗室小試、工藝初篩
MabSelect SuRe	85	50~60	0.5 mol/L	100~150	臨床前中試、常規發酵液
MabSelect SuRe LX	85	65~72	0.5 mol/L	120~160	高滴度補料發酵、批量制備
MabSelect PrismA	60	80	1.0 mol/L	180~220	商業化連續生產線

停留時間顯著影響動態載量：停留時間縮短至 2.4 min 時，PrismA 載量仍可達 65 mg/mL，適配快速連續層析；初代 MabSelect 載量下降超 30%，不適合高速生產。耐堿循環結果表明，PrismA 經 1.0 mol/L NaOH 連續 150 次循環后，動態載量僅下降 6.2%，配基泄漏＜5 ng/mg 抗體；初代 MabSelect 僅耐受 0.1 mol/L NaOH，同等循環下載量衰減 25% 以上，配基泄漏量提升 10 倍。

3.2 上樣 pH 對抗體結合效率的影響

上樣 pH 7.2~7.4 區間 IgG 與 Protein A 疏水、氫鍵結合作用強，抗體穿透量低，回收率穩定在 90% 以上；pH 低于 7.0 時分子間作用力減弱，抗體穿透流失，回收率下降 6%~10%；pH 高于 7.8 體系靜電排斥增強，非特異性吸附雜蛋白增多，HCP 殘留顯著上升。確定優上樣 pH 為 7.4。

3.3 多級洗滌體系除雜效果

僅使用 PBS 單一洗滌時，洗脫產物 HCP 殘留＞1200 ng/mg；增加 500 mM NaCl 高鹽洗滌后，疏水性宿主蛋白大量去除，HCP 降至 320 ng/mg；疊加 pH 6.0 弱酸預洗，解離弱結合雜蛋白與核酸雜質，HCP 降至 85 ng/mg，雜質去除率達 93% 以上，多級洗滌僅造成 1.2% 抗體回收率損失，除雜優勢顯著。

3.4 洗脫 pH 對抗體回收率與聚集的影響

洗脫 pH 3.2 條件下抗體解離，回收率 92.5%，但長期酸性環境引發抗體不可逆聚集，單體比例僅 86.3%；pH 3.8 洗脫聚集程度大幅降低，單體純度 96.8%，但洗脫不全，回收率降至 83.7%；綜合平衡回收率與產品質量，優洗脫 pH 為 3.5，洗脫液收集后立即用 Tris 中和至中性，可穩定維持單體純度 95% 以上。

3.5 CIP 在位清洗工藝優化

初代 MabSelect 僅允許 0.1 mol/L NaOH 單次接觸≤5 min，長期強堿清洗會造成配基水解脫落；SuRe、SuRe LX 系列可穩定使用 0.5 mol/L NaOH 清洗 10 min / 循環；PrismA 適配 1.0 mol/L NaOH 深度清洗，可有效去除脂質、蛋白沉積，同時實現病毒滅活。針對高脂質、高 HCP 發酵樣品，采用 100 mM 硫代甘油預處理后再堿洗，填料使用壽命可提升 30%。

3.6 不同類型抗體適配驗證

完整人源 IgG1/IgG2/IgG4 均可在全系列樹脂上高效捕獲，采用 PrismA 純化回收率穩定 90%~93%；雙特異性抗體優先選用 SuRe LX 與 PrismA，可通過梯度 pH 洗脫去除單臂副產物；Fab、VHH 等無 Fc 段抗體需搭配 MabSelect VH3 樹脂配套純化。

3.7 整體純化工藝綜合指標

采用 MabSelect PrismA 與優化后標準化工藝處理 CHO 發酵上清，整體純化指標：單抗總回收率 90.8%，洗脫單體純度 95.6%，HCP 殘留 82 ng/mg，宿主 DNA＜10 pg/mg，Protein A 配基泄漏 3.2 ng/mg，純化產物各項指標滿足離子交換、疏水層析精細純化進料標準。

4 討論

4.1 樹脂選型策略

實驗室小規模工藝篩選、低滴度樣品純化選用 MabSelect，采購成本低，滿足基礎研發需求；臨床前中試、常規滴度發酵液優先 MabSelect SuRe，平衡載量與耐堿性能，循環壽命適中；高滴度補料發酵、大批量樣品制備選用 MabSelect SuRe LX，加長間隔臂大幅提升動態載量，降低填料使用體積；商業化連續生產線、高雜質難純化樣品選擇 MabSelect PrismA，超高載量搭配 1.0 mol/L NaOH 深度清洗，大幅降低填料更換成本與綜合生產成本。

4.2 關鍵工藝控制要點

發酵上清必須經 0.22 μm 過濾，細胞碎片、脂質顆粒會堵塞樹脂孔道，造成載量性下降；高脂質發酵液可添加 0.05% CHAPS 預處理去除脂類雜質，不干擾 IgG 與 Protein A 結合；高速連續生產選用 PrismA 可將停留時間縮短至 2.4~4 min，高聚集、高粘度抗體延長停留時間至 6 min，保證抗體分子充分擴散至樹脂孔道；低 pH 洗脫液必須即時中和，避免抗體長時間酸性暴露引發聚集、電荷異質性升高；全套緩沖液與樹脂配套 Cytiva 法規支持文件（RSF），堿洗 CIP 步驟同步實現病毒滅活，滿足國內外新藥申報合規要求。

4.3 與傳統 Protein A 填料對比優勢

MabSelect 系列剛性交聯瓊脂糖可耐受 300 cm/h 高流速，柱壓低、無壓縮，同等柱體積處理量為傳統樹脂 3~4 倍；SuRe 與 PrismA 耐堿改造配基，循環次數提升 2~4 倍，顯著降低填料更換成本；配基單點穩定偶聯，游離 Protein A 滲漏量降低 90%，減少下游去除配基的額外工序；整套緩沖體系通用，工藝可線性放大，從 1 mL 實驗室小試柱直接放大至千升級工業層析柱，無明顯工藝偏移。

5 結論

本文系統完成 MabSelect 四代 Protein A 親和樹脂性能表征，建立一套標準化、可線性放大、合規的單抗捕獲層析工藝，優化平衡、多級洗滌、酸性洗脫、分級 CIP 全套緩沖與操作參數。MabSelect PrismA 綜合性能優，6 min 停留動態載量 80 mg IgG/mL，耐受 1.0 mol/L NaOH 在位清洗，穩定循環 200 次以上；兩級梯度洗滌體系高效去除宿主蛋白、DNA、脂質雜質，單抗回收率≥90%，單體純度＞95%。該工藝適配完整 IgG、Fc 融合蛋白、雙特異性抗體等各類治療性抗體，覆蓋實驗室研發、中試放大、商業化連續生產全場景，為生物制藥下游捕獲平臺工藝開發提供標準化技術參考，可直接用于工藝申報、放大生產與質量控制體系搭建。

MabSelect 系列 Protein A 親和樹脂單克隆抗體捕獲純化工藝優化研究

MabSelect 系列 Protein A 親和樹脂單克隆抗體捕獲純化工藝優化研究

摘要

0 引言

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

1.2 儀器設備

2 實驗方法

2.1 樹脂基礎性能表征

2.2 標準化層析緩沖液配方

2.3 標準層析操作流程

2.4 單因素工藝優化試驗

2.5 產品質量檢測方法

3 結果與分析

3.1 MabSelect 系列樹脂基礎性能對比

3.2 上樣 pH 對抗體結合效率的影響

3.3 多級洗滌體系除雜效果

3.4 洗脫 pH 對抗體回收率與聚集的影響

3.5 CIP 在位清洗工藝優化

3.6 不同類型抗體適配驗證

3.7 整體純化工藝綜合指標

4 討論

4.1 樹脂選型策略

4.2 關鍵工藝控制要點

4.3 與傳統 Protein A 填料對比優勢

5 結論

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