F1-X™ Next-Generation 1-Step Gibson Assembly® Master Mix

產(chǎn)品描述

F1-X™ 下一代吉布森組裝®主混合液是一種優(yōu)良的克隆試劑，旨在無縫DNA組裝的效率和精度。這種即用主混合液能夠單管克隆2至12個(gè)DNA片段，在復(fù)雜多片段構(gòu)造上表現(xiàn)出色。F1-X™在吉布森組裝®發(fā)明者丹·吉布森博士的指導(dǎo)下開發(fā)，代表了分子克隆技術(shù)的重大進(jìn)展。優(yōu)化后的酶混合物在所有片段計(jì)數(shù)上實(shí)現(xiàn)>95%的克隆效率，從簡單的2片段連接到復(fù)雜的12片段組裝。溫度柔韌性（50-56°C）適用于通常在標(biāo)準(zhǔn)克隆方法中失敗的GC富集和結(jié)構(gòu)序列。主要優(yōu)勢包括單步流程簡便、兼容未純化PCR產(chǎn)物（≤20% v/v）、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的10μL反應(yīng)體積，以及包含正對照DNA的全面質(zhì)量控制。理想應(yīng)用包括質(zhì)粒構(gòu)建、代謝途徑組裝、定點(diǎn)誘變、組合文庫生成以及需要可靠多片段克隆的合成生物學(xué)項(xiàng)目。F1-X™直接以NEBuilder® HiFi為基準(zhǔn)測試，涵蓋2段、7段、9段和11段組件，性能與競爭對手相當(dāng)甚至超過，同時(shí)每次反應(yīng)成本降低了30%。兼容自動(dòng)化液體處理系統(tǒng)，用于高通量克隆應(yīng)用。在-20°C下保質(zhì)期為12個(gè)月。 僅供研究使用。不用于診斷程序。

技術(shù)細(xì)節(jié)

工作流程：三步

三步就從碎片到驗(yàn)證的構(gòu)造體，無需特殊裝備

步驟1：合并碎片。將片段加入F1-X™母混音中，裝入一管。

第二步：孵化。50°C，持續(xù)15-60分鐘。

第三步：變身。直接轉(zhuǎn)化為合格細(xì)胞，或使用無細(xì)胞流程（PUREfrex®無細(xì)胞蛋白合成）。

F1-X在單步組裝混合物的直接比較中實(shí)現(xiàn)了最高的平均克隆率

多片段克隆準(zhǔn)確率的一對一比較。F1-X™實(shí)現(xiàn)了78.6%的無錯(cuò)誤克隆率，而NEBuilder® HiFi為64.3%，GeneArt™ Gibson Assembly HiFi為57.1%，Gibson組裝®克隆套件為42.9%。在4片段組裝且重疊40堿基對的組裝中，F(xiàn)1-X™在所有試劑盒中平均克隆準(zhǔn)確率最高。克隆準(zhǔn)確度通過全質(zhì)粒下一代測序確定，無錯(cuò)誤克隆定義為與參考序列100%相同，計(jì)算為無錯(cuò)誤克隆相對于測序總克隆的比例;在本次分析中，克隆準(zhǔn)確率和無錯(cuò)誤克隆率可互換使用。全長克隆體在牛津納米孔測序前通過視覺遺傳報(bào)告測定法預(yù)選完成。數(shù)據(jù)代表n=2個(gè)獨(dú)立克隆和轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，每次復(fù)制測序7個(gè)菌落;誤差條表示復(fù)制間的標(biāo)準(zhǔn)差。克隆效率和保真度依賴于構(gòu)造，且可能隨序列上下文和重疊設(shè)計(jì)而變化。Gibson Assembly®是Telesis Bio Inc.的注冊商標(biāo)，已授權(quán)使用。NEBuilder®是New England Biolabs， Inc.的注冊商標(biāo)。GeneArt™是Thermo Fisher Scientific的商標(biāo)。

在不斷增加的裝配復(fù)雜度中保持穩(wěn)定的效率和低錯(cuò)誤率

多片段克隆的高性能和保真度。F1-X™ 在簡單、單一組裝步驟中實(shí)現(xiàn)高克隆效率、穩(wěn)健的菌落計(jì)數(shù)和高保真度，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜克隆反應(yīng)——減少或消除多步驟組裝的需求。傳統(tǒng)的吉布森組裝方法可能需要分層組裝或兩步協(xié)議，以實(shí)現(xiàn)超過4–5個(gè)片段的可接受效率。相比之下，F(xiàn)1-X™在測試復(fù)雜度（4、7、9和11片段）中保持了95-97%的克隆效率和高保真度。面板（a）顯示了使用熒光報(bào)告系統(tǒng)計(jì)算的平均克隆效率，其中含有目標(biāo)插入片段的克隆體表達(dá)熒光報(bào)告蛋白（效率=熒光菌落數(shù) / 總菌落數(shù)）。還顯示了每個(gè)報(bào)告器的菌落數(shù)量，表明有足夠的菌落形成用于篩選，甚至多達(dá)11個(gè)片段。誤差條表示n=4瓊脂板象限間菌落計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差。面板（b）展示了高保真度，該精度由全質(zhì)粒次世代測序（NGS）測量。每個(gè)堿基測序的平均誤差由NGS共識序列中的缺口、不匹配或插入數(shù)除以測序的堿基總數(shù)（構(gòu)造體長度×測序克隆數(shù)）計(jì)算得出。基于制備方法估算輸入DNA的理論誤差率：對4和7片段組裝進(jìn)行PCR合成，9和11片段組裝則直接克隆合成片段。誤差條表示n=2個(gè)獨(dú)立克隆反應(yīng)與轉(zhuǎn)化之間的標(biāo)準(zhǔn)差，每個(gè)復(fù)制序列7個(gè)菌落。2/58 NGS共識痕跡（3.4%）包含可能因讀值質(zhì)量或映射偽影導(dǎo)致的序列缺口，并被排除在保真度分析之外。實(shí)驗(yàn)方法按照F1-X用戶指南的建議進(jìn)行。碎片設(shè)計(jì)采用標(biāo)準(zhǔn)40堿基對重疊，以等摩爾比（每片0.02–0.04 pmol）組合，并在標(biāo)準(zhǔn)等溫條件下組裝（50°C，1小時(shí)）。合成DNA片段（Twist Bioscience）直接使用或在組裝前通過PCR擴(kuò)增。無需優(yōu)化碎片比例、特殊重疊設(shè)計(jì)或多步驟組裝。轉(zhuǎn)化過程中，將1微升F1-X反應(yīng)轉(zhuǎn)化為20微升化學(xué)能力強(qiáng)的DH5α，再用SOC在220微升總體積中回收，然后進(jìn)行電鍍。請注意，克隆的效率和保真度取決于構(gòu)造，且可能隨序列上下文和重疊設(shè)計(jì)而變化。

 F1-X™ Next-Generation 1-Step Gibson Assembly® Master Mix

F1-X在反復(fù)凍融應(yīng)力后仍能保持11片段組裝性能

F1-X對反復(fù)凍融循環(huán)具有韌性。許多實(shí)驗(yàn)室會(huì)在常規(guī)使用中出現(xiàn)主混合液或不可避免的凍融事件。在一項(xiàng)11片段組裝壓力測試中，F(xiàn)1-X經(jīng)過5次凍融循環(huán)，與新鮮主混合液相比，（a）菌落數(shù)量、（b）克隆效率（~95%）或（c）組裝忠實(shí)度均無明顯下降。值得注意的是，兩種條件的錯(cuò)誤率（2.7–7.8×10?? 誤差/堿基對）都遠(yuǎn)低于輸入合成DNA片段的錯(cuò)誤率標(biāo)準(zhǔn)（1：7,500 bp 或 ~13 × 10??），證實(shí)F1-X組裝能保持輸入DNA的忠實(shí)度，而不會(huì)引入額外錯(cuò)誤。值得注意的是，所有反應(yīng)輸入均為合成板直接的合成片段。虛線表示合成片段錯(cuò)誤率，供參考。注：由于其甘油含量，F(xiàn)1-X在-20°C時(shí)保持液態(tài);然而，在-20°C和室溫之間循環(huán)時(shí)，試劑會(huì)反復(fù)承受模擬現(xiàn)實(shí)儲(chǔ)存和操作條件的熱應(yīng)力。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)如下。轉(zhuǎn)化：1微升反應(yīng)為20微升化學(xué)能力強(qiáng)的DH5α，保存在220微升總體積中，30微升為鍍基。n=2個(gè)復(fù)制，每個(gè)復(fù)制測序7個(gè)菌落;（c）中的誤差條表示重復(fù)次數(shù)之間的標(biāo)準(zhǔn)差。（a）和（b）中的誤差條代表n=4瓊脂板象限中菌落計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差。請注意，克隆的效率和保真度取決于構(gòu)造，且可能隨序列上下文和重疊設(shè)計(jì)而變化。

F1-X 組裝產(chǎn)品支持無轉(zhuǎn)化、同日線性DNA工作流程

F1-X生產(chǎn)適合無細(xì)胞應(yīng)用且無需轉(zhuǎn)化的組裝產(chǎn)物。對于需要線性DNA模板的工作流程，如體外轉(zhuǎn)錄、游離蛋白表達(dá)或直接PCR擴(kuò)增，F(xiàn)1-X組裝產(chǎn)物可直接使用，無需細(xì)菌克隆。面板（a）展示了組裝到擴(kuò)增工作流程的概述。該方法特別適用于納入復(fù)雜序列元素，如多重（A）尾部，這些元素在細(xì)菌宿主中難以維持。面板（b）展示了瓊脂糖凝膠電泳組裝產(chǎn)物（左）及隨后的PCR擴(kuò)增（右），適用于簡單（1片段插入+載體）和更復(fù)雜的（3片段插入+載體）組裝。通道1和通道2代表獨(dú)立復(fù)制。原始組裝產(chǎn)物顯示組裝中間體和未組裝片段的預(yù)期階梯;在組裝后連接處進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，兩種條件均分化為一個(gè)預(yù)期大小的銳利1.7 kb能帶，且無檢測到組裝錯(cuò)誤或低分子量產(chǎn)物。這表明無論插入件復(fù)雜度如何，連接效率均較高。組裝采用標(biāo)準(zhǔn)F1-X推薦條件，在50°C下運(yùn)行15分鐘。1微升未純化組裝產(chǎn)品直接加入Platinum™ SuperFi™ II反應(yīng)（根據(jù)制造商建議設(shè)置的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)）進(jìn)行擴(kuò)增。所有構(gòu)造體隨后均由國家統(tǒng)計(jì)學(xué)會(huì)（NGS）進(jìn)行序列驗(yàn)證，確認(rèn)組裝精度。這一簡化的工作流程使得當(dāng)天生成序列驗(yàn)證的線性模板，適用于無需或不希望轉(zhuǎn)化的應(yīng)用。一般建議簡單組裝（≤3個(gè)片段）組裝時(shí)間為15分鐘;對于復(fù)雜度較高的組裝體，建議按照F1-X用戶指南規(guī)定的60分鐘反應(yīng)時(shí)間。對于本實(shí)驗(yàn)來說，15分鐘足夠組裝2片段和4片段構(gòu)造。

上海寶葉生物科技有限公司

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