前言

研究表明，T細胞經快速激活后需立即轉入長期培養階段。T細胞長期培養是連接基礎免疫學研究與臨床轉化應用的關鍵技術平臺，該體系通過模擬體內慢性刺激微環境，可動態追蹤T細胞從初始狀態向效應態、記憶態或耗竭態演變的連續軌跡，為深入探索并精準解析T細胞命運決定的分子開關（如TCF-1、TOX）提供理想工具。

同時，借助優化的細胞因子組合（如 IL-2/IL-7/IL-15）及代謝調控策略，可規模化富集干細胞樣記憶T細胞（TSCM）等“干性"亞群，為新一代細胞療法的開發提供優質種子細胞。

上篇推文中已詳細介紹T細胞長期培養的關鍵起始步驟——體外快速激活的核心策略與技術要點。本期推文Elabscience將為大家介紹T細胞長期培養實驗方案及相關技術要點，包括更換含 IL-2/IL-7/IL-15 的低刺激強度培養基、維持3-4周動態傳代等核心操作；培養期間，需定期檢測T細胞表型標志物（CD62L、CD45RA、CD45RO、PD-1、CD95、CD197）、功能效應特征（IFN-γ分泌水平、增殖能力）及線粒體活性，以實時評估細胞干性維持狀態與耗竭進展。

本次重點對比分析人外周血單個核細胞（PBMCs）、陰性分選的人外周血 CD3+T細胞及陰性分選的人外周血Pan Naive T細胞，在僅含 IL-2（無 IL-7+IL-15）的單細胞因子培養基中培養20 d的增殖狀態、細胞表型變化，及短期培養內的細胞代謝特征，期望能為各位老師的實驗提供參考。

一、實驗結果展示

1.1 T細胞長期培養表型檢測和代謝功能檢測

圖1. T細胞長期培養狀態和功能檢測。（A）人外周血分離 PBMCs，CD3/CD28 磁珠激活5 d去磁珠，培養至20 d，檢測CD4/CD8比值及T細胞亞群（TN、TCM、TEM、TEMRA、TSCM）分布。（B）人外周血分選CD3+T細胞，同（A）方法培養20 d，檢測CD4/CD8比值及上述亞群比例。（C）人外周血分選Pan Naive T細胞，同（A）方法培養20 d，檢測CD4/CD8 比值及目標亞群比例。（D、E）三種初始 T 細胞0-20 d增殖動力學及20 d凋亡水平檢測，無 IL-7和IL-15活性單邊的細胞培養基中，三種細胞的增殖數目均在第12 d顯著下降。（F）記憶T細胞（Tmem）與初始T細胞（Tnaive）葡萄糖攝取能力比較，記憶T細胞群糖攝取能力高于初始T細胞。（G）人外周血分選出CD3+T細胞，CD3/CD28磁珠激活3 d，與對照組比較細胞內ATP代謝水平，激活后ATP顯著升高。（H）人外周血分選CD4+Tnaive和CD4+Tmem 細胞，檢測細胞的胞外酸化率（ECAR），CD4+Tmem 細胞糖酵解水平更高。（I）人外周血分選CD4+Tnaive和CD4+Tmem 細胞，檢測細胞的氧消耗速率（OCR），CD4+Tmem 細胞線粒體呼吸顯著低于CD4+Tnaive細胞。

結果分析

• 在缺乏IL-7和IL-15的培養基中，三種細胞的增殖數量均于培養第12 d顯著下降。

• PBMCs培養過程中，CD4/CD8比值呈逐漸下降趨勢，干細胞樣記憶T細胞（TSCM）與效應記憶 T 細胞（TEM）比例逐步升高，于第20 d達峰值；其中 CD8+TSCM細胞比例顯著高于CD4+TSCM，CD4+TEM 比例顯著高于CD8+TEM，而CD8+終末分化效應記憶T細胞（TEMRA）比例明顯高于CD4+TEMRA。

• 以陰性分選的人外周血CD3+T 細胞為初始細胞，CD4/CD8比值在培養第5-7 d顯著升高后逐步下降，TSCM與中yang記憶T細胞（TCM）比例持續上升并于第20 d達峰值；其中CD4+TSCM細胞比例略高于CD8+TSCM，CD4+TEM比例顯著高于CD8+TEM，CD8+TEMRA比例顯著高于CD4+TEMRA。

• 以陰性分選的人外周血Pan Naive T 細胞為初始細胞，CD4/CD8比值在培養第2 d下降后持續升高，于第20 d達zui大值；增殖過程中TSCM 比例變化不顯著，細胞亞群中以TCM占比zui高。

1.2 T細胞其他激活培養場景細胞因子分泌功能檢測

圖2. ELISPOT檢測T細胞功能。將PBMC在不含或含刺激劑Anti-CD3 mAb（500 ng/mL）的條件下孵育20 h，ELISPOT檢測T細胞相關因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17A的表達。

圖3. 人PBMC細胞（1×10? Cells/mL）未經處理或用10 μg/mL PHA +10 ng/mL PMA或用PMA(50 ng/mL)+ Ionomycin (500 ng/mL)刺激培養1天，ELISA測定細胞培養上清液IFN-γ/IL-2/IL-4/IL-17A含量。

二、實驗操作流程

2.1 試劑配制和準備

• T細胞激活培養基：10% FBS+1×L-谷氨酰胺（2 mM）+1×青霉素-鏈霉素-新霉素（PSN）的RPMI-1640基礎培養基。

• T細胞長期培養培養基：IL-2（50 U/mL）+10% FBS+1×L-谷氨酰胺（2 mM）+1×青霉素-鏈霉素-新霉素（PSN）的RPMI-1640基礎培養基（本次不添加 IL-7和IL-15）。

2.2 細胞分選流程

• 取新鮮的人外周血，分選出PBMC細胞，詳細操作流程見Human PBMC Separation Solution(P 1.077)（E-CK-A103）產品說明書。

• 取新鮮的人外周血，分選出PBMC細胞，使用EasySort™ Human CD3+T Cell Isolation Kit（MIH001N）和EasySort™ Human Na?ve Pan T Cell Isolation Kit（MIH006N）分選出CD3+T細胞和Pan Naive T細胞，詳細操作流程可參考產品說明書。

2.3 細胞快速激活和長期培養流程

• 分選出的細胞使用T細胞激活培養基重懸，細胞計數，150-300×g，離心3分鐘，棄上清。

• 使用T細胞激活培養基重現細胞沉淀，調整細胞密度到1×10?/mL。

• 按照細胞數目取合適體積的Human CD3/CD28 T Cell Activation Beads（MIH001A），加入1 mL的T細胞激活培養基，磁吸洗滌1次，重懸后與細胞共孵育，37℃、5% CO?培養24小時完成初始激活（詳細步驟可參考產品說明書）。

• 24 h后補充二分之一激活培養基，繼續激活培養48-96 h后，磁吸去除激活微球。

激活結束后，使用T細胞長期培養培養基（IL-2單因子維持培養基）重懸細胞，調整細胞密度到5×10?/mL，37℃、5% CO?培養，每日觀察細胞狀態并拍照，細胞培養過程每48 h半換液，每96 h全換液。并于第0、2、5、7、12、14、20天取樣，檢測細胞亞群和細胞凋亡狀態。詳細檢測流程可參考鏈接。

三、注意事項

• 采集樣本一定要嚴格遵循無菌操作規范，于超凈臺內完成所有步驟。

• 樣本采集后盡可能在4 h內完成分選實驗，分選后若來不及激活，可使用激活培養基重懸細胞，短暫保存于4℃冰箱暫存，保存時間不超過3 h。

• 細胞激活3-5天內需根據細胞狀態及時去除激活微球，避免持續刺激誘導過早耗竭。可設置細胞和磁珠的梯度比例及梯度激活時間，選擇z佳的激活條件。

• 每次全換液傳代前需鏡檢確認細胞活率＞90%，并記錄細胞形態、聚團程度及懸浮/貼壁比例；若活率低于閾值，需立即終止實驗并溯源污染或操作偏差。傳代時采用輕柔吹打法收集細胞，嚴禁劇烈震蕩或反復吸吹，以減少機械損傷與非特異性凋亡。

• 傳代收集細胞，離心力zui大不超過300×g，若死細胞較多，可降低離心力至100-150×g以去除死細胞；離心機升速不超過3，降速不超過2，降低離心導致的細胞損失。

• 細胞檢測過程注意添加Human Fc Receptor Blocking Solution進行封閉，并通過Fixable Viability Kit染色去除死細胞，獲取更準確的數據。

小結

本次實驗詳細對比了三種來源T細胞起始群體（PBMCs、CD3⁺T細胞、Pan Naive T細胞）在IL-2單因子長期培養體系下的擴增效能、亞群命運軌跡與功能穩態維持能力，三者存在顯著差異，若您對于詳細細節想要了解更多，歡迎在評論區留言交流。后續我們將持續分享T細胞長期培養代謝檢測和狀態分析策略，敬請期待！

參考文獻

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