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蛋白結(jié)構(gòu)研究分析
一、研究背景
上個(gè)世紀(jì)初，科學(xué)家們認(rèn)為蛋白質(zhì)是生命體的遺傳物質(zhì)，而具有*的作用。隨著這個(gè)理論被證偽，真正的遺傳物質(zhì)DNA的結(jié)構(gòu)被給予了很大關(guān)注。然而，蛋白質(zhì)作為生命體的重要大分子，其重要性也從未被忽視，而且在1950年代開(kāi)始，科學(xué)家一直在探尋DNA序列和蛋白質(zhì)序列的相關(guān)性。與此同時(shí)，蛋白質(zhì)測(cè)序和結(jié)構(gòu)解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的努力開(kāi)始慢慢獲得回報(bào)。更多的生化研究揭示了蛋白質(zhì)的功能重要性，因此蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)的解析對(duì)于深入理解蛋白質(zhì)功能和生理現(xiàn)象起著決定性作用
圖1:蛋白三維結(jié)構(gòu)圖
二、蛋白結(jié)構(gòu)研究的發(fā)展
時(shí)間 | 科學(xué)家 | 事件 |
1958年 | John Kendrew和Max Perutz | X射線衍射得到的高分辨率的肌紅蛋白Myoglobin的三維結(jié)構(gòu)，然后是更加復(fù)雜的血紅蛋白Hemoglobin |
1964年 | Aaron Klug | 提出了一種基于X射線衍射原理發(fā)展而來(lái)的全新的方法電子晶體學(xué)顯微鏡（crystallographic electron microscopy ），可以解析更大蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)核酸復(fù)合體結(jié)構(gòu) |
1969年 | Benno P. Schoenborn | 提出可以用中子散射和原子核散射來(lái)確定大分子中固定位置的氫原子坐標(biāo)。 |
1976年 | Robert Langride | 將X-ray衍射數(shù)據(jù)可視化，并在加州大學(xué)圣地亞哥分校成立了一個(gè)計(jì)算機(jī)圖形實(shí)驗(yàn)室 |
1985年 | John Deisenhofer等 | 德國(guó)科學(xué)家解析出了細(xì)菌光合反應(yīng)中心，因此他們共享了1988年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 |
2001年 | Roger Kornberg | 描述了第—個(gè)高精度的RNA聚合酶三維結(jié)構(gòu)，正因此五年后他們共享了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 |
2007年，第—個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)的解析更是對(duì)藥物研究帶了新的希望。近些年來(lái)，越來(lái)越多的大的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)得到解析。Cryo-EM超低溫電子顯微鏡成像用于超大蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)成像的研究日益成熟，并開(kāi)始廣泛用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析 | ||
三、蛋白結(jié)構(gòu)研究的意義
示例1：來(lái)自阿貢國(guó)家實(shí)驗(yàn)室等處的研究者利用高特異性的X射線晶體學(xué)技術(shù)解析了低氧誘導(dǎo)性因子（HIFs）的蛋白結(jié)構(gòu)，低氧誘導(dǎo)性因子是腫瘤對(duì)低氧反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)子，該研究或?yàn)閷ふ倚滦退幬锴袛?/span>癌細(xì)胞的氧氣和營(yíng)養(yǎng)供給終治療癌癥提供新的思路。
示例2：A型流感病毒（Influenza A virus，IAV）屬于正黏病毒科，是一個(gè)有囊膜的、分節(jié)段的單股負(fù)鏈的RNA病毒，不同亞型流感病毒與受體的結(jié)合主要是靠HA蛋白實(shí)現(xiàn)的，HA與受體的結(jié)合具有種屬特異性。在H7N9亞型流感病毒HA在演化過(guò)程中，它首先由禽特異性結(jié)合的G186Q226變成雙受體結(jié)合特性的V186Q226，后演變成V186L226，這些研究有利于深入理解H7亞型禽流感病毒跨種傳播的分子機(jī)制，對(duì)于流感病毒疫情的預(yù)防與控制具有重要指導(dǎo)作用。
圖2:H7N9 HA受體結(jié)合特性演化模式圖
示例3：非洲豬瘟是一個(gè)世界難題，有近百年的流行歷史，由于沒(méi)有疫苗和其他治療手段，撲殺豬是眼下控制疫情zui有效的方法。2019年，研究團(tuán)隊(duì)采用單顆粒三維重構(gòu)的方法*解析了非洲豬瘟病毒全顆粒的三維結(jié)構(gòu)，闡明了非洲豬瘟病毒*的5層（外膜、衣殼、雙層內(nèi)膜、核心殼層和基因組）結(jié)構(gòu)特征，有這個(gè)理論的指導(dǎo)，可以幫助我們未來(lái)設(shè)計(jì)更安全、更有效的疫苗，從范圍來(lái)講，理論的意義是非常大的。
圖3:非洲豬瘟的全顆粒結(jié)構(gòu)
四、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的研究過(guò)程和實(shí)驗(yàn)方法
蛋白結(jié)構(gòu)分析包含一系列產(chǎn)品的選擇用于免疫印跡、蛋白電泳、蛋白定量、蛋白色譜、質(zhì)譜。
圖4:蛋白結(jié)構(gòu)研究過(guò)程
蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的方法主要是兩種，x射線衍射和NMR。
1、單晶培養(yǎng)技術(shù)及結(jié)構(gòu)分析技術(shù)
1）蛋白質(zhì)結(jié)晶方法
2）結(jié)構(gòu)分析技術(shù)
（1）x射線衍射
x射線衍射是將表達(dá)蛋白的基因PCR之后克隆到一種表達(dá)載體中，然后在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，提純之后摸索結(jié)晶條件，等拿到晶體之后，工作便完成的80%，將晶體進(jìn)行x射線衍射，收集衍射圖譜，通過(guò)一系列的計(jì)算，很快就能得到蛋白質(zhì)的原子結(jié)構(gòu)。
圖5:x射線衍射原理
（2）NMR
首先通過(guò)基因工程的方法，表達(dá)出目的蛋白，提純之后，摸索一下蛋白穩(wěn)定的條件，如果蛋白沒(méi)有聚合，而且折疊良好，便將蛋白樣品（通常是1mM～3mM，500ul，pH6～7的PBS）裝入核磁管中，放入核磁譜儀中，然后用一系列寫(xiě)好的程序控制譜儀，發(fā)出一系列的電磁波，激發(fā)蛋白中的H、N13、C13原子，等電磁波發(fā)射完畢，在收集受激發(fā)的原子所放出的“能量”，其實(shí)也是小磁場(chǎng)，通過(guò)收集數(shù)據(jù)、譜圖處理、電腦計(jì)算從而得到蛋白的原子結(jié)構(gòu)。
圖6:血紅蛋白結(jié)構(gòu)建模
x射線與NMR技術(shù)特點(diǎn)
| 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
x射線衍射 | 速度快：通常只要拿到晶體，甚至當(dāng)天就能得到結(jié)構(gòu) 不受大小限制：無(wú)論是多大的蛋白，或者復(fù)合體，無(wú)論是蛋白質(zhì)還是RNA、DNA，還是結(jié)合了什么小分子 | 射線方法解析蛋白的瓶頸是摸索蛋白結(jié)晶的條件， |
NMR | 蛋白在液體中得到結(jié)構(gòu)，是一個(gè)動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)，因?yàn)槭莿?dòng)態(tài)就很容易的研究蛋白與其他蛋白或者配基的相互作用。 | 受大小的限制（上限是50kd。） 蛋白表達(dá)量要大，一定要在胞質(zhì)中表達(dá) 蛋白要折疊。 |
（3）Cryo-EM超低溫電子顯微鏡成像
近些年來(lái)，Cryo-EM被用來(lái)解析很多結(jié)構(gòu)非常大（無(wú)法用X-ray解析）的蛋白質(zhì)（或者蛋白質(zhì)復(fù)合體），取得了非常好的結(jié)果。同時(shí)，單電子捕捉技術(shù)取代之前的光電轉(zhuǎn)換成像的CCD攝像設(shè)備，減少了圖像中的噪音和信號(hào)衰減，同時(shí)并增強(qiáng)了信號(hào)。計(jì)算機(jī)成像技術(shù)的成熟和進(jìn)步，也賦予了Cryo-EM更多的進(jìn)步空間。然而，Cyro-EM與X-ray不同，該方法不需要蛋白質(zhì)成為晶體，相同的是都需要低溫環(huán)境來(lái)減少粒子束對(duì)樣品的損害。
圖7:KIF1A殘基和微管蛋白之間的相互作用。
五、蛋白結(jié)構(gòu)相關(guān)產(chǎn)品信息
1、反轉(zhuǎn)錄
反轉(zhuǎn)錄是以RNA為模板，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶，合成DNA的過(guò)程。是DNA生物合成的一種特殊方式。反轉(zhuǎn)錄是進(jìn)行基因工程過(guò)程中，以RNA為模板提取出DNA遺傳信息的過(guò)程。
分類 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 | 價(jià)格（¥） |
單酶 | HifairTM II Reverse Transcriptase | 11110ES92/93 | 1/5×10KU | 626/2456 |
高靈敏度單酶 | HifairTM III Reverse Transcriptase | 11111ES92/93 | 1/5×10KU | 1426/4626 |
Kit | HifairTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit | 11119ES60 | 100T | 755 |
高靈敏度Kit | HifairTM III 1st Strand cDNA Synthesis Kit | 11135ES70 | 200T | 1836 |
Kit（含gDNA去除步驟） | HifairTM III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) | 11139ES70 | 200T | 2196 |
預(yù)混液 | HifairTM II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR | 11120ES60 | 100T | 855 |
高靈敏度預(yù)混液 | HifairTM III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR | 11137ES70 | 200T | 2126 |
2、PCR試劑
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。
相關(guān)產(chǎn)品
分類 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 | 價(jià)格（¥） |
基本PCR | HieffTM Taq DNA Polymerase | 10101ES80/90 | 1/5 KU | 155/735 |
HieffTM Robust PCR Master Mix（With Dye） | 10106ES08 | 5mL | 265 | |
高保真PCR | Hieff Canace® High-Fidelity DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶 | 10135ES60/76/80 | 100/500/1000U | 626/2356/4256 |
Hieff Canace® Gold High-Fidelity DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶 | 10148ES60/76/80 | 100/500/1000U | 683/2383/4256 | |
2×Hieff Canace® Gold PCR Master Mix高保真酶預(yù)混液 | 10149ES03/08 | 1/5mL | 553/1453 | |
熱啟動(dòng)型PCR | HieffTM HotStart Taq DNA Polymerase （配體法熱啟動(dòng)DNA聚合酶） | 10110ES72/80 | 1/4×250U | 186 /636 |
多重PCR | 2× Hieff CanaceTM PCR Master Mix 高保真酶預(yù)混液 （for multiplex PCR） | 10138ES03/08 | 1/5mL | 625/2355 |
組織直擴(kuò)PCR | Animal Tissue Direct PCR Kit 動(dòng)物組織直接PCR試劑盒 | 10180ES50/70 | 50/200T | 326/755 |
Mouse Tissue Direct PCR Kit (With Dye) | 10185ES50/70 | 50/200T | 323/982 |
3、分子克隆
在分子水平上提供一種純化和擴(kuò)增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過(guò)轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，引入適合的寄主體內(nèi)得到復(fù)制與擴(kuò)增，然后再?gòu)暮Y選的寄主細(xì)胞內(nèi)分離提純所需的克隆載體，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴(kuò)增。
分類 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 | 價(jià)格（¥） |
單個(gè)片段連接 | Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit 一步法快速克隆試劑盒HOT | 10911ES25/62 | 25T/5×25T | 655/2455 |
1-5個(gè)片段連接 | Hieff CloneTM Plus Multi One Step Cloning Kit 多片段一步法快速克隆試劑盒HOT | 10912ES10/50 | 10T/5×10T | 457/1967 |
替代TA連接克隆 | Hieff CloneTM Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆試劑盒HOT | 10907ES20 | 20T | 625 |
Hieff CloneTM Zero TOPO-TA Simple Cloning Kit, MCS-Depleted 零背景TOPO-TA克隆試劑盒（不含MCS多克隆酶切位點(diǎn)） | 10908ES20 | 20T | 625 | |
替代平末端連接克隆 | Hieff CloneTM Zero TOPO-Blunt Cloning Kit 零背景TOPO-Blunt平末端克隆試劑盒HOT | 10909ES20 | 20T | 625 |
Hieff CloneTM Zero TOPO-Blunt Simple Cloning Kit 零背景TOPO-Blunt平末端克隆試劑盒（不含MCS多克隆酶切位點(diǎn)） | 10910ES20 | 20T | 625 |
4、抗生素
抗生素，是指由微生物（包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬）或高等動(dòng)植物在生活過(guò)程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)。
分類 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 | 價(jià)格（¥） |
克隆篩選用抗生素 | Carbenicillin, Disodium Salt | 60202ES08/25/60 | 5/ 25/100g | 358/1428/4628 |
Ampicillin, Sodium Salt 氨芐青霉素鈉 | 60203ES10/60 | 10/100g | 108/968 |
5、蛋白濃度測(cè)定及SDS-PAGE膠
分類 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 | 價(jià)格（¥） |
蛋白提取 | RIPA Lysis Buffer (Strong) RIPA裂解液（強(qiáng)） | 20101ES60 | 100ml | 228 |
蛋白濃度測(cè)定 | BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型) | 20201ES76/86/90 | 500T/2500T/5000T | 288/818/1518 |
Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒 | 20202ES76/86 | 500T/2500T | 98/398 | |
Marker | GoldBand 3-color Regular Range Protein Marker（10-180 kDa）三色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) | 20351ES76/90 | 2×250/10×250 μL | 585/1985 |
GoldBand 3-color Regular Range Protein Marker（10-245 kDa）三色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) | 20352ES76/90 | 2×250/10×250μL | 615/2315 | |
預(yù)制膠 | Precast Protein Improve Gels, 10 wells 高分辨率梯度預(yù)制膠,10孔 | 36231ES10 | 4%-20%，1盒（10塊） | 378 |
Precast Protein Improve Gels, 10 wells 高分辨率固定濃度預(yù)制膠,10孔 | 36233ES10 | 10%，1盒（10塊） | 378 |
6、蛋白純化
蛋白純化是生命科學(xué)研究領(lǐng)域中一項(xiàng)重要操作技術(shù)，其廣泛應(yīng)用于蛋白功能、結(jié)構(gòu)和相互作用的研究。翊圣生物提供全線蛋白純化產(chǎn)品，包括純化樹(shù)脂、預(yù)裝柱和層析空柱等，可高效、便捷分離純化目的蛋白，為下游應(yīng)用提供良好保證，更大范圍滿足您的實(shí)驗(yàn)需求
分類 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 | 價(jià)格（¥） |
Flag親和純化凝膠 | Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel（Anti-Flag親和純化凝膠） | 20585ES03/08/25/60 | 1/5/25/100 mL | 1936/6236/27286/96756 |
His標(biāo)簽蛋白瓊脂糖純化樹(shù)脂 | HisSep Ni-NTA Agarose Resin （His標(biāo)簽蛋白瓊脂糖純化樹(shù)脂） | 20502ES10/50/60 | 10/50/100 mL | 678/2848/5328 |
HisSep Ni-NTA Superflow Resin （His標(biāo)簽蛋白瓊脂糖高速純化樹(shù)脂） | 20503ES10/50/60 | 10/50/100 mL | 798/3358/5838 | |
HisSep Ni-NTA 6FF Spin Column, 5ML（His標(biāo)簽蛋白純化預(yù)裝柱） | 20504ES08/25 | 5/5×5 mL | 728/2938 | |
HisSep Ni-NTA 6FF Spin Column, 1ML（His標(biāo)簽蛋白純化預(yù)裝柱） | 20505ES03/08 | 1/5×1 mL | 298/1048 | |
Imidazole咪唑 | 20501ES60/76 | 100/500 g | 223/553 | |
GST標(biāo)簽蛋白瓊脂糖純化樹(shù)脂 | GSTSep Glutathione Agarose Resin 谷胱甘肽瓊脂糖樹(shù)脂 | 20507ES10/50/60 | 10/50/100 mL | 928/3848/6898 |
GSTSep Glutathione Superflow Resin 谷胱甘肽高速純化樹(shù)脂 | 20508ES10/50/60 | 10/50/100 mL | 1238/4568/7928 | |
GSTSep Glutathione 4FF Spin Column, 1ML（GST標(biāo)簽蛋白純化預(yù)裝柱） | 20509ES03/08 | 1/5×1 mL | 328/1348 | |
GSTSep Glutathione 4FF Spin Column, 5ML（GST標(biāo)簽蛋白純化預(yù)裝柱） | 20510ES08/25 | 5/5×5 mL | 938/3928 | |
Glutathione,Reduced (GSH) 還原型谷胱甘肽（GSH） | 60342ES10/60/80 | 10/100/1000 g | 209/1156/4596 | |
核酸酶 | Benzonase Nuclease (Endotoxin-free) 全能核酸酶無(wú)內(nèi)毒素 | 20125ES25/50/60 | 25/50/100 KU | 1125/1965/3245 |
Benzonase Nuclease 全能核酸酶 | 20156ES25/50/60 | 25/50/100 KU | 418/768/1398 |
六、其他產(chǎn)品
分類 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 | 價(jià)格（¥） |
普通PCR | HieffTM PCR Master Mix (With Dye) | 10102ES08 | 5mL | 150 |
HieffTM Robust PCR Master Mix（With Dye） | 10106ES08 | 5mL | 265 | |
HieffTM HotStart PCR Genotyping Master Mix（With Dye） | 10108ES08 | 5mL | 345 | |
高保真PCR | Hieff Canace® Gold High-Fidelity DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶 | 10148ES60/76/80 | 100/500/1000U | 683/2383/4256 |
2×Hieff Canace® Gold PCR Master Mix高保真酶預(yù)混液 | 10149ES03/08 | 1/5mL | 553/1453 | |
熱啟動(dòng)型PCR | UNICON™ HotStart Taq DNA Polymerase （抗體法熱啟動(dòng)Taq酶） | 10113ES60/76/88 | 100U/500U/3000U | 216/656/3665 |
2×UNICONTM HotStart PCR Master Mix (With Dye) | 10111ES03/08 | 5mL | 432 | |
2×UNICONTM HotStart PCR Master Mix（No dye） | 10112ES03/08 | 5mL | 432 | |
多重PCR | HieffTM Multiplex PCR Kit（Mg2+ free） | 13278ES50/76 | 100/500T | 875/3165 |
HieffTM Multiplex PCR Kit | 13279ES50/76 | 100/500T | 875/3165 | |
HieffTM Multiplex PCR Master Mix | 13280ES50/76 | 50/200T | 875/3165 | |
5× Hieff CanaceTM PCR Master Mix 高保真酶預(yù)混液 （for multiplex PCR） | 10137ES03/08 | 1/5mL | 1215/3065 | |
組織直擴(kuò)PCR | Mouse Tissue Direct PCR Kit 小鼠組織直接PCR試劑盒 | 10181ES50/70 | 50T/200T | 326/755 |
Animal Blood Direct PCR Kit 全血直接PCR試劑盒 | 10182ES50/70 | 50T/200T | 326/755 | |
Plant Tissue PCR Kit 植物組織直接PCR試劑盒 | 10183ES50/70 | 50T/200T | 326/755 | |
其他克隆相關(guān)產(chǎn)品 | T4 DNA Ligase T4 DNA 連接酶HOT | 10301ES40 | 40KU | 446 |
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase TDT末端轉(zhuǎn)移酶 | 10302ES76 | 500U | 1156 | |
Taq DNA Ligase Taq DNA 連接酶HOT | 11051ES80/84/92 | 1/2/10KU | 346/656/2616 | |
*0 Chemically Competent Cell *0化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞 | 11801ES80/92 | 10 /100×100μL | 166/1236 | |
DH5α Chemically Competent Cell DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞 | 11802ES80/92 | 10/100×100μL | 166/1236 | |
X-Gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷 | 10901ES03/08 | 1/5g | 426/1746 | |
X-α-Gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷 | 10903ES25/60/72/76 | 25/100/250/500mg | 399/769/1259/1979 | |
蛋白標(biāo)簽切割酶 | Enterokinase, Recombinant, Expressed in E. coli 大腸桿菌表達(dá)重組腸激酶（不帶標(biāo)簽） | 20401ES60/70/76 | 100/200/500 U | 425/645/1245 |
Bovine Thrombin, High Specific Activity, >2000 IU/mg 牛凝血酶（高活力，>2000 IU/mg） | 20402ES03/05 | 1/2 KU | 536/956 | |
rTEV Protease 重組煙草蝕紋病毒蛋白酶 | 20403ES80/92/10/50 | 1/10/10×1/50 KU | 986/6756/7856/27556 |
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