蛋白質(zhì)的修飾有多種類型，除了常見的無機(jī)和有機(jī)小分子修飾，如磷酸化、糖基化、脂酰化等，還有一類用小肽進(jìn)行修飾的，例如泛素化（ubiquitination），類泛素化NEDD化（neddylation）、ISGylation蘇木化（SUMOylation）等。而泛素-蛋白酶體系統(tǒng)則負(fù)責(zé)特異性地降解大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)蛋白（約占 80% 以上），是一種高效蛋白降解途徑。泛素化修飾還可以直接影響蛋白質(zhì)的活性和定位，調(diào)控包括細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA 損傷修復(fù)以及免疫應(yīng)答等在內(nèi)的多種細(xì)胞活動(dòng)。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)組成

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）包括：泛素、泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3，26S蛋白酶體以及去泛素化酶。

泛素分子結(jié)構(gòu) 圖片來源：維基百科

蛋白質(zhì)泛素化降解的途徑

靶蛋白的泛素化降解是經(jīng)過幾個(gè)連續(xù)的過程來完成的，主要分為五步：

①　E1類酶激活泛素，該過程需要ATP（三磷酸腺苷）提供一定能量；

②　泛素激活酶E1將活化的泛素分子傳遞給E2類酶；

③　泛素連接酶E3將結(jié)合E2的泛素連接到靶蛋白上；

④　被標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子尾端形成一小段泛素分子鏈；

⑤　26s蛋白酶體特異性地識(shí)別這個(gè)帶有泛素標(biāo)簽的底物蛋白，將其降解掉。

泛素化過程 圖解來源：維基百科

總的來說，靶蛋白是在泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3的依次作用下共價(jià)連接上幾個(gè)泛素分子，最后被26s蛋白酶體特異性地識(shí)別并降解成小肽，泛素在去泛素連接酶的作用下進(jìn)行回收利用，這些小肽再被細(xì)胞質(zhì)中的蛋白酶降解為氨基酸。

26S 蛋白酶體降解泛素化標(biāo)記的蛋白質(zhì)

泛素-蛋白酶體途徑發(fā)現(xiàn)具有劃時(shí)代意義

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）可以控制特定蛋白質(zhì)的壽命，從而調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，是生命科學(xué)領(lǐng)域重要的發(fā)現(xiàn)。由于這一發(fā)現(xiàn)2004年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)被授予以色列理工學(xué)院的亞倫·西查諾弗（Aaron Ciechanover）和阿夫拉姆·赫什科（Avram Hershko），以及美國(guó)加州大學(xué)的歐文·羅斯（Irwin Rose）三位科學(xué)家。

研究方向

◆ 細(xì)胞周期控制：細(xì)胞周期進(jìn)程是由一系列細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）來進(jìn)行調(diào)控的，而 CDK 則是由細(xì)胞周期蛋白（cyclin）來激活。在 CDK-cyclin 復(fù)合物行使了它的功能之后，復(fù)合物中的 cyclin 就會(huì)被多泛素化并由蛋白酶體降解，從而保證了細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)裂解作用發(fā)生異常時(shí)，人體就會(huì)產(chǎn)生不適甚至疾病，（如子宮頸癌癥和囊腫纖維癥等）。

◆ 腫瘤藥物研究：蛋白酶抑制劑可以誘發(fā)處于快速分裂中的細(xì)胞（如癌細(xì)胞）的凋亡，因此一些蛋白酶抑制劑已經(jīng)被開發(fā)并作為化療藥品被用于治療癌癥，硼替佐米是第一種用作化學(xué)治療藥物的蛋白酶體抑制劑。主要被用于多發(fā)性骨髓瘤的治療，在治療B細(xì)胞相關(guān)癌癥的臨床前和早期臨床研究特別是一些類型的非霍奇金氏淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma）有顯著效果。

◆ 調(diào)控植物生長(zhǎng)：茁長(zhǎng)素（auxin）或植物激素（phytohormone）的作用是調(diào)控植物生長(zhǎng)的方向和向性，它們通過細(xì)胞信號(hào)通路來誘導(dǎo)一系列轉(zhuǎn)錄因子抑制蛋白（Aux/IAA 蛋白）進(jìn)入蛋白酶體降解途徑。

◆ 細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)：當(dāng)細(xì)胞應(yīng)激（如感染、熱休克以及氧化損傷）反應(yīng)發(fā)生時(shí)，熱休克蛋白被大量表達(dá)，其作用是識(shí)別錯(cuò)誤折疊或去折疊的蛋白質(zhì)，并標(biāo)記它們以供蛋白酶體降解。

◆ 晚發(fā)型神經(jīng)退行性疾病新靶點(diǎn)：阿爾茲海默癥（AD）、帕金森病（PD）代表性的有 PINK1/Parkin 通路。在 PINK1/Parkin 通路中，Parkin 蛋白具有 E3 泛素連接酶活性，新的 PD 治療方法聚焦于增強(qiáng)線粒體泛素化或抑制去泛素化，如激活 Parkin 蛋白，或抑制去泛素化酶 USP30。

◆ 免疫系統(tǒng)中的作用：蛋白酶體被認(rèn)為與炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病相關(guān)。蛋白酶體活性水平的提高與包括牛皮癬、哮喘、紅斑性狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的自身免疫性疾病相關(guān)。

如何檢測(cè)蛋白是否泛素化

1. 免疫印記、免疫沉淀

通過免疫共沉淀方法將某一特定蛋白以及與其結(jié)合的蛋白分離出來（其中包括被泛素化修飾的蛋白）。分離出來的蛋白再進(jìn)行SDS電泳，使用泛素抗體western blot分析。這一方法可以明確具體哪個(gè)蛋白的哪個(gè)發(fā)生了泛素化修飾。可以初步判斷某蛋白具有泛素化功能；

2. 體外泛素標(biāo)記突變位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)

將我們要研究的蛋白（被泛素化的蛋白），通過蛋白提取試劑盒提取內(nèi)源性蛋白或者通過基因工程技術(shù)重組表達(dá)后提純。在體外與K63-orK48-linked ubiquitin chain petides一系列酶，E1,E2,E3在適合條件下孵育，然后通過western blot并用泛素化抗體進(jìn)行檢測(cè)。這一方法可以明確要研究的蛋白哪個(gè)賴氨酸殘基容易發(fā)生泛素化。

3. 體外泛素化實(shí)驗(yàn)

在體外反應(yīng)buffer中將我們要研究的蛋白A（被泛素化的蛋白）與UBE1，Ubc13和UBE2V2 complex，Tag-ubiquitin以及我們要研究的蛋白B（具有泛素連接酶E3活性），共同進(jìn)行孵育。將孵育后的產(chǎn)物進(jìn)行IP和WB分析。這一方法可以明確引起B(yǎng)蛋白是引起A蛋白發(fā)生泛素化修飾的且具有E3連接酶活性。

4. 實(shí)驗(yàn)步驟

（1）反應(yīng)體系配制：

準(zhǔn)備好E3 Ubiquitin Ligase （可重組表達(dá)或從細(xì)胞裂解液中純化），Substrate (可選)不能檢測(cè)底物蛋白自泛素化。

（2）反應(yīng)條件：37℃孵育 （30min-2h），建議使用 PCR 儀或金屬浴

（3）結(jié)果檢測(cè)：

取樣品 20 μL 加入 5 μL 的 5× SDS-PAGE Buffer（加入 1 μL 新鮮配制的 1M DTT），加熱樣品 95℃ 5 min，隨后使用還原性（含 DTT）上樣緩沖液進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳分析;

選擇 E3 Ubiquitin Ligase、泛素、Substrate 抗體進(jìn)行 Western-blot 分析。

如上圖泳道2，4，6實(shí)驗(yàn)組，底物蛋白均被泛素化

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