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漲知識 | qPCR專場六：一文讀懂qPCR文章金標準-MIQE

2023-9-15　　閱讀(632)

熒光定量PCR是實驗室中出鏡率非常高的一種檢測方法。該方法通過在PCR體系中添加熒光基團來記錄DNA產物的累積情況，從而達到對PCR過程進行實時監控的目的，并且可以通過數據分析計算出起始模板量，這就是“熒光定量"中“定量"一詞的來源。

熒光定量PCR實驗因為靈敏度高所以經常是差之毫厘謬以千里，所以在實驗過程中，我們需要注意諸多細節，謹慎操作。小伙伴們看到這里就要著急了，我怎樣才能做好qPCR實驗，拿到實驗結果，發表高分文章，走上人生巔呢？

日常在進行qPCR時，需要注意多個操作細節，有時稍不留意就會拿到奇怪的實驗結果或拿不到數據結果。另外在最后的數據計算及統計學分析上，不同人對于數學的理解不同，會導致不同的實驗出現相同的結果，不同的人對同份數據進行分析，得出的結論也不相同。發表的文章如果缺乏充足的實驗細節，將會妨礙審稿人、編輯等對于結果質量的評估，或者讓小伙伴難以根據文章重復實驗。

2009年，Stephen A等人發表文章《The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments》，這是一群qPCR大牛經過商討制定的qPCR實驗和發表文章指南，其目的是為了作者根據指南提供相關的實驗條件和實驗特點，審稿人據此可以評價實驗所用方法的可靠性，其他研究人員也可以利用這些信息進行重復實驗。

MIQE指南由9個部分組成，共涉及85個參數，以保證qPCR實驗的實用性、準確性和可重復性。這9 部分包括實驗設計、樣本、核酸提取、反轉錄、靶標基因、qPCR引物和探針、qPCR實驗報告、qPCR合理性和數據分析。85個參數針對qPCR結果的重要性，分為了兩類：其中標記為“E"表示必須(essential)，標記為“D"表示建議(desirable)。

實驗設計

科學準確的實驗設計是基因表達分析研究的關鍵。由于在整個研究過程中，目的RNA的轉錄易受到研究過程中其他無關的外部刺激因素干擾，因此嚴格設計實驗條件的工作十分重要。重要內容包括了確定實驗組和對照組的條件、重復組的類型和數量(例如生物重復和技術重復)、實驗程序、實驗進行條件以及各組內樣品的處理方法等等。

樣本采集與處理

樣本采集可能是實驗變異的第一個變異來源，尤其是RNA相關的實驗，因為RNA容易被樣本的采集和處理方式干擾而不穩定。建議將新鮮組織保存在低溫環境中。樣本采集時應相當謹慎，應詳細記錄組織樣本的采集以及是否及時處理等信息。如果樣本沒有及時處理，需記錄是如何保存的，以及在什么情況下保存了多長時間。

核酸提取與質量控制

核酸提取是第二個關鍵步驟，尤其是RNA提取，確保使用高純度和未降解的RNA是熒光定量PCR實驗中最關鍵的一點。提取效率取決于樣本類型、樣本密度、樣本來源的生理狀態、樣本處理量等等。這些過程細節對于組織中提取RNA的數量和質量影響重大，故需記錄核酸提取方法的細節。

針對提取得到的RNA等核酸進行量化十分重要，尤其是在比較分析不同樣本時，RNA等核酸投入一致或類似的數量能夠避免一系列不確定因素。另外RNA等核酸的質量評估也必不。常見的量化和質量評估方法有多種，最為常見的是分光光度法，但需要注意的是A260/A280比值必須在中性PH值buffer中進行測量，吸光度比值會受到DNA或者殘余苯酚的影響而改變且不能評估核酸是否發生降解，故最好搭配其他檢測方法，例如瓊脂糖凝膠電泳、或者是參考基因/靶基因3‘：5’完整性檢測。如果RNA樣本部分降解，該信息在發表文章時需要告知，因為低水平轉錄檢測的敏感性可能降低，其中降解帶來的差異可能會造成不同的實驗結論。

RNA提取過程中也應包括DNA酶處理步驟，用以去除相關的基因組DNA污染。建議對RNA樣本是否經過DNA酶處理(包括DNase類型和反應條件)等做好記錄。

核酸中雜質殘留的檢測應通過稀釋樣本做反轉錄以檢測反轉錄活性或PCR抑制程度，或者采用SPUD等抑制實驗。

反轉錄

由于環境中普遍存在RNA酶，建議在RNA質量評估后立即將RNA樣本反轉錄成cDNA，從而避免RNA多次反復凍融造成的降解風險。反轉錄時，建議使用相同數量的RNA進行1次或3次反轉，并保證所有實驗的反轉錄時間相同，從而最小化生物重復之間的變異性。對于RNA轉化成cDNA的方法和試劑描述必不，例如RNA投入量，試劑的詳情，酶投入量，溫度，反應時間和操作步驟等等。

qPCR

qPCR分析時，須準備好以下信息：每個靶標基因和內參基因的database accession numbers，每個引物和任何探針的外顯子位點，每個寡核苷酸的序列和濃度，包括性質、位點和結合任何染料和/或修飾堿基。還需要聚合酶的濃度和特性，每個反應模板的質量，鎂離子的濃度，緩沖液的確切化學成分和反應體積。對應使用的儀器型號、耗材和所有PCR反應條件信息也應做好記錄。耗材多為塑料制品，不同制造商的塑料在熒光反射和靈敏度方面表現出很大差異。96孔板使用時，密封方法的不同也會影響板材周邊樣品的蒸發。

由于擴增效率高度依賴于所用的引物，因此也需要將序列進行公開。

引物的二級結構

核酸的結構(例如莖環二級RNA結構)對于反轉錄和PCR的效率有著重要的影響。故而引物、探針和PCR擴增產物的位點需考慮到RNA的折疊。

引物的特異性

引物的特異性需用直接的實驗數據驗證有效性，例如凝膠電泳、熔解曲線、DNA測序、擴增子大小、和/或限制性酶切驗證。一些引物優化的證據或方案最好也可提供，理想的形式是退火溫度梯度或Mg2+濃度梯度摸索并以Cq值、熒光與循環曲線圖的形式呈現數量和/或熔解曲線。

質控和定量標準

所有qPCR反應都需要進行額外的質控或定量標準品，例如使用NTC檢測PCR污染。每96孔板或每批樣品上樣應包括NTC，并確定數據不符合的條件，舉個例子，如果未知低濃度的Cq值為35，則可以忽略Cq值≥40的NTC。

性能分析

4.1擴增效率

穩定和精確的熒光定量PCR檢測通常和高效的擴增效率相關。尤其當檢測經內參基因校準的目的基因mRNA濃度時，擴增效率尤為重要。△△Cq法是測定樣品間不同基因表達情況用的方法之一，是基于單個內參基因的校準進行的。計算靶標基因和內參基因的Cq值的差異，并直接比較不同樣本之間的△Cq，這種情況需要兩個基因能以可比的效率進行擴增，方能進行比較。

擴增效率必須通過標準曲線來確定，因為這種校準方法提供了一個簡單、快速以及可重復擴增效率、分析敏感性和實驗穩定性的平均指標。擴增效率根據標準曲線對數線性部分的斜率確定。每個靶標基因的的標準曲線需提交在稿件中，這樣審稿人能夠看到。

4.2線性動態范圍

根據生成的標準曲線的模板，動態范圍應至少包括3個數量級，理想狀態是5或6 Log10濃度。標準曲線的線性區間需包括被定量的靶標基因的區間。由于定量下限通常定義不明確，應當確定線性區間內低濃度的變化。同時需要展示相關系數(R2 值)

4.3靈敏度(LOD)

LOD的定義是可以檢測到95%的陽性樣品的低濃度。換言之，在一組含有目的基因的重復實驗中，在LOD濃度下，不應發生超過5%的失敗反應。實際上，我們可以通過有限稀釋法來檢測，失敗和成功反應的百分比覆蓋泊松分布即可。

4.4精度

熒光定量PCR結果的變化有多種原因，包括溫度的差異可影響退火或變性，移液誤差引起的濃度差異和隨機變化。qPCR精度和濃度相關，一般隨著拷貝數的降低而降低。理想情況下，實驗內的重復性應當以SD error bar或具有重復樣品的標準曲線上的CIs的形式顯示在圖中。CVs不應與Cqs一起使用，但可用于表達拷貝數或濃度的差異。

多重熒光定量PCR

多重實驗大大擴展了qPCR分析的能力，特別是應用于同時檢測點突變或多態性檢測。多重熒光定量PCR實驗需要證明多個靶標的準確量化在同一管中不會受到干擾，即，擴增效率和靈敏度和進行單重實驗時是一致的。這點當豐度較低的靶標基因和豐度高的靶標基因進行共同擴增時尤為重要。

數據分析

數據分析包括對原始數據的檢查、對數據質量和可靠性的評估，以及生成可報告的結果。

均一化

均一化是進行科學qPCR分析的一個重要組成部分，該過程控制核酸抽提效率、反轉錄效率和擴增效率的變化，從而能夠比較不同樣本的RNA濃度。使用內參基因作為內部對照是最常見的均一化RNA數據的方法。均一化包括靶標基因和內參基因的RNA濃度之比。內參基因的RNA應穩定表達，其基因豐度與樣品中mRNA總量呈現強相關。

均一化通常不能用一個內參基因，除非作者可為審稿人提供明確的證據證實內參基因在其實驗條件下表達恒定。內參基因的最佳數目和選擇需通過文章具體實驗確定并報告方法。

變異性

生物體本身固有的變異性可能與組間的實驗差異相匹敵，甚至超過后者。尤其是使用許多生物學重復來提高實驗的統計學重要性時，這種變化就變得顯而易見。雖然生物重復間的差異可能很大，但是足夠數量的樣本可以減少實驗差異性。許多因素會導致實驗變異，從而影響到達統計所需的生物重復的數量。因此，功效分析(power analysis)有助于確定有效可靠結論所需的樣本數。

定性分析

使用PCR僅檢測核酸是否存在，而不是對其進行準確定量，被稱為定性PCR，該方式廣泛應用于病原體診斷。PCR方法定性/定量分層問題在于，準確回答是或否，需要低敏感性PCR實驗的敏感性信息。因此，即使是定性分析也應提供有關分析能力的相關信息。

術語統一

實時定量PCR的簡寫

建議將縮寫qPCR用于real-time PCR，并將RT-qPCR用于反轉錄-qPCR。將RT-PCR簡稱為qPCR會引起混淆，并且與傳統RT-PCR的應用不符。

內參基因

內參基因應當指的是參照基因(reference genes)，而不是管家基因(housekeeping genes)。

TaqMan探針

TaqMan探針應指為水解探針(hydrolysis probes)。

FRET probe

FRET probe (fluorescence resonance energy transfer probe, 熒光共振能量轉移探針)指的是一種機制，指發射/猝滅依賴于兩個熒光染料分子的電子激發態之間相互作用。LightCycler型探針指的是雙雜交探針(dual hybridization probes) 。

定量 quantification

牛津英語詞典只列出了定量(quantification)，非定量(non-quantification)，因quantification是恰當的，而不是quantitation。

現在文獻中使用的閾值循環(threshold cycle, Ct)，交點(crossing point, Cp)和分支點(take-off point, TOP) 與PCR循環的術語不一致。這些術語指的實際上是相同的值，只是由于不同儀器廠家由于產品差異化的原因造成的，不具有科學的準確性和清晰性。根據RDML（Real-Time PCR Data Markup Language）數據標準，建議統一使用定量循環(quantification cycle, Cq)這個術語。

※該指南的目的主要有三個：

1. 讓作者能夠設計和報告具有更大內在價值的qPCR實驗。

2. 給到審稿人和編輯既定標準用于衡量所收稿件的技術質量。

3.遵守指南中的準則，人們可以更容易地重復已發表研究中所描述的實驗。

以上是對qPCR金標準指南-MIQE的介紹，相信小伙伴們通過小翌的介紹，對MIQE指南已經有一定的了解啦。關于如何做好qPCR實驗，小翌會陸續在公眾號里傳授秘籍噠，敬請期待哦。

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