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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 貨號 | 40905ES02 |
|---|---|---|---|
| 應用領域 | 醫療衛生,生物產業 |
產品介紹
Coelenterazine 400a 腔腸素400a
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 | 儲存 | 價格（元） |
Coelenterazine 400a 腔腸素 400a | 40905ES02 | 1×500μg | -20℃避光 | 789.00 |
Coelenterazine 400a 腔腸素400a | 40905ES03 | 2×500μg | -20℃避光 | 1499.00 |
背景描述
腔腸素（Coelenterazine）是自然界中資源zui豐富的天然熒光素，是絕大多數海洋發光生物（超過75%）的光能貯存分子。腔腸素可作為許多熒光素酶的底物，比如海腎熒光素酶（Rluc），Gaussia分泌型熒光素酶（Gluc），以及包括水母發光蛋白（aequorin）和藪枝螅發光蛋白（Obelia）在內的光蛋白（Photoproteins）。其發光原理是：以腔腸素為底物的熒光素酶在有分子氧的條件下，氧化腔腸素，產生高能量的中間產物，并在此過程中發射藍色光，峰值發射波長約為450~480nm。
腔腸素作為水母發光蛋白復合物（Aequorin）的組成成分，只有與鈣離子（Ca2+）結合后，才能被氧化生成高能量產物Coelenteramide，同時釋放出CO2和藍色熒光（~466nm）。其具有以下幾個優點：1）能檢測較大范圍的Ca2+濃度（0.1-100μM）；2）樣品無自體熒光，背景熒光較低，盡管信號較熒光鈣離子指示劑弱，但信噪比更高，因此具有較高靈敏度；3）Aequorin能夠穩定維持在細胞內，能夠進行數小時至數天Ca2+的監測。
圖1. 腔腸素作為水母發光蛋白輔助因子的Ca2+依賴反應流程
腔腸素具有能量轉移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer，BRET）的特性：在底物腔腸素存在的情況下，熒光素酶（如Rluc）催化底物發生藍光，能量轉移到EYFP（增強的黃色熒光蛋白），發出綠光（~530nm）。通過Rluc融合蛋白和EYFP融合蛋白兩者間的相互關系研究蛋白-蛋白之間的相互作用。BRET的信號可通過比較綠光和藍光的量來進行測定，消減了因細胞數、細胞類型和其他實驗變量而引起的數據變量。
主要應用
1. 活體成像。
2. 報告基因檢測。
3. 檢測細胞/組織內活性氧（ROS）水平：細胞和組織內的超氧陰離子和過氧化亞硝基陰離子能夠增強腔腸素在酶非依賴性的氧化體系中自發熒光。
4. 高通量篩選。
5. 監測活細胞內鈣離子水平。
產品描述
Coelenterazine 400a 腔腸素 400a系天然腔腸素衍生物，是海腎熒光素酶（Rluc）的良好底物，但不能被Gaussia分泌型熒光素酶（Gluc）氧化。它的zui大發射波長在400nm左右，對GFP受體蛋白的信號干擾zui小，使得其成為BRET研究的*腔腸素類底物。
產品性質
英文別名（English synonym） | DeepBlueCTM; Di-dehydro Coelenterazine |
CAS號（CAS NO.） | 70217-82-2 |
分子式（Formula） | C26H21N3O |
分子量（Molecular weight） | 391.48g/mol |
外觀（Appearance） | 黃色至橘色粉末 |
溶解性（Solubility） | 溶于甲醇和乙醇，不溶于DMSO |
純度（Purity）（TLC） | >98% |
結構（Structure） |
|
運輸和保存方法
冰袋運輸。粉末-20℃避光干燥保存，保存在惰性氣體環境下，避免接觸空氣。
腔腸素400a工作液的配制
腔腸素400a溶解特性：不溶于水。目前毒性zui低的溶劑是100%乙醇，可配制濃度為0.1-1mg/ml。加入pH低于7.0的酸性緩沖液（堿性pH會快速降解底物）稀釋成低濃度工作液。切忌溶于DMSO。
腔腸素400a保存特性：建議溶液現配現用！體外實驗，需將稀釋后的工作液室溫放置20-30min，方可穩定工作。該工作液可室溫穩定放置3-4h，有非常微弱的信號衰減發生。不建議儲存液-20℃或更低溫度保存，因為其高能量的二氧環丁酮結構即使在低溫的情況下也會發生降解，導致熒光強度明顯變弱。短時間保存條件：-70℃避光保存于塑料管內（溶液中不含有Ca2+），且有惰性氣體保護。
腔腸素工作液的配制：稱取1mg腔腸素400a粉末溶解于1ml乙醇（或甲醇）中配置成濃度為1mg/ml的母液。用商業化的Rluc反應緩沖液稀釋到300µM（如127µl母液+1ml Rluc反應緩沖液）。然后取1.1ml 300µM溶液加入到6.6ml PBS中，混勻。
BRET 生物發光共振能量轉移（可根據具體實驗發生變動）
詳細步驟可參考文獻：Gersting SW, et al. Bioluminescence resonance energy transfer:an emerging tool for the detection of protein-protein interaction in living cells. Methods Mol Biol. 815:253-63 (2012)。
本步驟以Rluc的融合蛋白作為能量供體，YFP的融合蛋白作為能量受體，兩者同時電轉化進入細胞，并通過加載腔腸素400a底物來啟動氧化反應，通過分析兩者BRET信號來研究兩個蛋白之間的相互作用。
1. 按照正常流程將能表達兩個融合蛋白的質粒，按照3:1的比例（YFP : Rluc）共電轉染進入細胞。
2. 轉染后24h進行BRET信號的檢測。吸去培養液（留約30μl）后，將96孔板放到熒光酶標儀上。
3. 至少在測定前15min準備腔腸素400a工作液。
4. 用超純水清洗注射泵后，讓泵開始自動吸取配制好的400a工作液，按照每孔70µl工作液的量順序加入，使得每孔中底物的終濃度為30µM。進樣結束后，孵育2min。之后立即進行雙波長熒光信號讀數，即Rluc信號（485nm）和BRET信號（535nm）。
BRET信號值計算
為了能夠進行數據評估，轉染細胞的Rluc信號（485nm）應當超過非轉染對照細胞的（平均值+9×標準誤差）的區間。
1. BRET–ratio（BRET信號比）基于以下等式進行計算，
R=（IA/ID）-cf
R代表BRET比值，ID表示受體YFP熒光信號的強度（535nm），IA表示供體Rluc熒光信號的強度（485nm），cf表示校準因子（BRETcontrol/Rluccontrol D），對照樣本是指共轉染YFP融合蛋白質粒和不含供體第二個研究蛋白的Rluc載體的細胞熒光信號。
2. 陽性對照，使用YFP-Rluc融合蛋白的BRET比值為1.0。
3. 若蛋白之間有陽性反應，必須檢測到：8組蛋白樣本中至少有一組能夠產生超過設定閾值0.1以上的BRET信號比值。
注意事項
1. 粉末使用惰性氣體（氮氣或氬氣），在密封良好的塑料管中避光保存于-20℃，長期保存于-70℃。管內即使存在少量空氣，可能造成腔腸素cp氧化失活，造成在不同試驗間的量化分析結果無法比較。
2. 本品接觸空氣，水或者任何氧化試劑會不穩定。
3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
附錄1. 腔腸素及其衍生物的特性
貨號 | 產品名稱 | 基本描述 | Em (nm) | RLC* | Relative Intensity | Half-rise time (ms)** |
40904 | 天然腔腸素 Coelenterazine native | 水母發光蛋白的輔助因子，高靈敏度化學發光法檢測Ca2+濃度（0.1~100µM）。常用作Rluc和Gluc等熒光素酶的報告基因檢測底物。BRET分析，以及細胞/組織樣本中的超氧陰離子和過氧化亞硝基陰離子的化學發光檢測?？焖僭偕芰Ρ容^重要的實驗推薦使用本底物。 | 466 | 1.00 | 1 | 6-30 |
40906 | 腔腸素h Coelenterazine h | 一種水母發光蛋白復合物，其發光強度比天然腔腸素高10倍以上。適用于報告基因分析。 | 466 | 0.75 | 16 | 6-30 |
40910 | 腔腸素hcp Coelenterazine hcp | 腔腸素hcp-水母發光蛋白復合物的熒光強度比天然腔腸素復合物高190倍，且量子產量高和Ca2+反應速度快。 | 445 | 0.65 | 500 | 2-5 |
40909 | 腔腸素cp Coelenterazine cp | Coelenterazine cp 光蛋白復合物的發光強度是天然腔腸素的15倍，且具有更快的Ca2+反應性。 | 442 | 0.63 | 28 | 2-5 |
40908 | 腔腸素f Coelenterazine f | 腔腸素f-光蛋白復合物的發光強度是天然腔腸素的20倍。其具有的細胞滲透性。當需要*的檢測Ca2+靈敏度研究水母蛋白再生實驗研究中，推薦使用本底物。 | 472 | 0.80 | 20 | 6-30 |
40911 | 腔腸素n Coelenterazine n | 所有的腔腸素衍生物中熒光強度是zui弱的，且對Ca2+反應速率也明顯低于天然腔腸素。非常有用的Ca2+低靈敏檢測底物。 | 468 | 0.25 | 0.15 | 6-30 |
40912 | 腔腸素e Coelenterazine e | 具有zui高的體外水母發光蛋白反應性，且具有雙發射峰，可在pCa5-7范圍內通過雙波長的比例測定Ca2+濃度，從而提高檢測精確性。腔腸素e的熒光強度是天然腔腸素的137%。 | 405 & 465 | 0.5 | 4 | 0.15-0.3 |
40913 | 2-methyl Coelenterazine 二甲基腔腸素 | 可高效作用于ROS（如單態氧、超氧陰離子），是一種已報道的強抗氧化劑。 | / | / | / | / |
40905 | 腔腸素 400a Coelenterazine 400a | BRET研究中Rluc的*底物。在390nm和400nm之間發藍色光，對GFP受體蛋白的光發射干擾zui小。不可作為Gluc底物。 | 400 | / | / | / |
*RLC = relative luminescence capacity : Total time-integrated emission of aequorin in saturating Ca2+ relative to native aequorin = 1.0 **Half-Rise Time : The half-rise time is the time for the luminescence signal to reach 50% of the maximum after addition of 1mM Ca2+ to a standard of aequorin reconstituted with the coelenterazine analog of interest. All data are from O. Shimomura in Cell Calcium 14, 373 (1993). | ||||||
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Coelenterazine hcp 腔腸素hcp | 40910ES72 | 1×250μg | 2359.00 |
Coelenterazine n 腔腸素n | 40911ES72 | 1×250μg | 2359.00 |
Coelenterazine e 腔腸素e | 40912ES02 | 1×500μg | 1329.00 |
40912ES03 | 2×500μg | 2359.00 |
