一、標準概述

GB 31658.6-2021《食品安全國家標準 動物性食品中四環素類藥物殘留量的測定 高效液相色譜法》是由中華人民共和國農業農村部、國家衛生健康委員會、國家市場監督管理總局聯合發布的國家標準。該標準按照GB/T 1.1-2020《標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草，系首次發布。標準于2021年9月16日發布，2022年2月1日正式實施，全文共12頁。

該標準的發布，為動物性食品中四環素類藥物殘留的檢測提供了統一、規范的技術依據，對于保障食品安全、加強獸藥殘留監控具有重要意義。

二、制定背景

四環素類藥物（包括土霉素、四環素、金霉素、多西環素等）具有抗菌譜廣、價格低廉的優點，在畜禽和水產養殖中廣泛用作飼料添加劑，以防治疾病和促進生長。然而，這類藥物在動物體內易產生累積和殘留。

四環素類藥物對人體的危害不容忽視。它們易與人體中的鈣結合，沉積于骨骼和牙齒中，抑制骨骼和牙齒的生長發育，尤其對胎兒和嬰幼兒影響較大，可導致牙齒持久染色變黃；此外，還可在肝臟中沉積，長期累積會造成肝臟和腎臟的損傷。鑒于其健康風險，國家對動物源性食品中的四環素類藥物殘留限量有嚴格的規定，配套的殘留限量標準為GB 31650-2019《食品中獸藥最大殘留限量》。GB 31658.6-2021正是為配合限量標準的執行而制定的配套檢測方法標準。

三、適用范圍

本標準適用于豬、牛、羊、雞的肌肉、肝臟和腎臟，豬、雞的皮+脂肪，雞蛋，牛奶，魚皮+肉，蝦肌肉中四種四環素類藥物殘留量的檢測，具體目標物包括：

·         土霉素（Oxytetracycline）

·         四環素（Tetracycline）

·         金霉素（Chlortetracycline）

·         多西環素（Doxycycline，又稱強力霉素）

該標準覆蓋了動物性食品的主要品類和養殖動物種類，具有較強的普適性。

四、檢測原理與方法

4.1 方法總覽

本標準采用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）作為核心檢測手段。檢測流程主要包括樣品制備、提取、固相萃取凈化、液相色譜分離、紫外檢測器檢測、外標法定量等環節。

4.2 樣品前處理

樣品前處理是四環素類藥物殘留檢測的關鍵環節。由于動物性食品基質復雜（含有大量蛋白質、脂肪等干擾物），必須經過充分的提取和凈化才能獲得可靠的檢測結果。

（1）提取

試樣經均質后，采用乙二胺四乙酸二鈉（EDTA·2Na）-McIlvaine緩沖溶液進行提取。EDTA的加入可與金屬離子形成絡合物，防止四環素類藥物與金屬離子螯合而影響提取效率。提取液經離心后取上清液待凈化。

（2）固相萃取凈化

標準采用兩級固相萃取（SPE）凈化策略，即使用反相聚合物小柱（如PEP-2、HLB等）和磷酸化聚苯乙烯二乙烯苯高聚物小柱（如LCX）配合使用，以實現動物源性樣品的深度凈化。

具體凈化流程為：提取液先經反相聚合物小柱凈化，用甲醇洗脫目標化合物；洗脫液經適當處理后，再上樣至LCX固相萃取柱進行二次凈化。LCX固相萃取柱的磷酸官能團可通過離子交換作用特異性吸附四環素類藥物。最后用草酸乙腈溶液洗脫，收集洗脫液后經氮氣吹干、定容、過濾，即可上機檢測。

值得注意的是，四環素類藥物對熱不穩定、見光易分解。因此，在前處理過程中應注意避光操作，氮吹溫度一般控制在40℃以下。制備好的上機溶液應在24小時內完成測定。

4.3 液相色譜條件

色譜柱：采用反相C18色譜柱，常用規格為4.6×150 mm，5 μm。

流動相：乙腈與0.01 mol/L草酸溶液的混合溶液，典型比例為25:75（v/v）。草酸的加入有助于改善四環素類藥物的色譜峰形，減少拖尾。

檢測波長：紫外檢測器，檢測波長為350 nm或365 nm。

流速：1.0 mL/min。

柱溫：30℃。

進樣體積：50 μL。

4.4 定量方法

采用外標法進行定量。將待測樣品的色譜峰面積與標準溶液的色譜峰面積進行比較，計算樣品中四種四環素類藥物的殘留量。

五、方法學性能指標

5.1 線性范圍與相關系數

在0.05~5 μg/mL濃度范圍內，土霉素、四環素、金霉素和多西環素的線性相關系數R2均≥0.9994，表明該方法在較寬的濃度范圍內具有良好的線性關系。

5.2 檢出限與定量限

方法的檢出限（LOD）可低至0.5 μg/kg級別，定量限（LOQ）可達1.5 μg/kg。不同基質和不同藥物可能略有差異，但整體靈敏度較高，完全能夠滿足殘留監控的需求。

以土霉素為例，方法檢出限可低至12 μg/kg，遠低于GB 31650中規定的限量值（土霉素40 μg/kg、四環素100 μg/kg）。

5.3 回收率與精密度

方法在添加濃度0.4 mg/kg（400 μg/kg）水平下，基質加標回收率可達85%以上。10 μg/mL混合標準溶液連續進樣5針，峰面積RSD＜2%，表明儀器精密度良好。

六、檢測關鍵點與注意事項

6.1 四環素類藥物的化學不穩定性

四環素類化合物在不同pH條件下以不同形態存在：

·         pH＜2時，以脫水四環素類形式存在；

·         2＜pH＜6時，以差向四環素類形式存在；

·         pH＞9時，會發生內酯化現象。

因此，在整個檢測過程中嚴格控制溶液的pH值至關重要。

此外，四環素類藥物熱穩定性較差、見光易分解。建議標準儲備液（100 μg/mL）在-18℃以下避光保存，有效期1個月；混合標準工作液現用現配。

6.2 固相萃取環節的優化

在實際應用中發現，標準中固相萃取步驟可能存在回收率不理想的情況。主要原因有兩方面：

一是上樣液有機相比例過大，洗脫能力太強，導致目標物在LCX固相萃取柱上吸附不充分；二是四環素類抗生素離子化不充分，與LCX固相萃取柱磷酸官能團的結合效率低。

針對這些問題，可采取以下優化措施：

·         將甲醇洗脫液中的2 mL水替換為2 mL 8 mM磷酸二氫鈉水溶液（pH 5.0） ，通過調節pH增強填料對藥物的吸附效率；

·         最后定容時直接用草酸溶液（0.01 M） 定容至2 mL，消除溶劑效應。

6.3 與相關標準的銜接

GB 31658.6-2021是GB 31650-2019《食品中獸藥最大殘留限量》的配套檢測方法標準。實際檢測中，應根據GB 31650規定的限量值進行結果判定。例如，羊肝、腎組織中四環素類藥物的限量值均為100 μg/kg。

此外，四環素類藥物殘留還可采用GB 31658.17-2021（同時測定四環素類、磺胺類和喹啉酮類）等其他標準進行檢測。實驗室可根據具體檢測需求和儀器配置選擇適當的方法。

七、總結

GB 31658.6-2021作為動物性食品中四環素類藥物殘留檢測的專項國家標準，具有以下突出特點：

一是覆蓋面廣。涵蓋了豬、牛、羊、雞、魚、蝦等多種動物源食品以及肌肉、肝臟、腎臟、脂肪、雞蛋、牛奶等多種基質。

二是目標物明確。針對土霉素、四環素、金霉素、多西環素四種最常用的四環素類藥物進行檢測。

三是方法可靠。采用高效液相色譜法配合兩級固相萃取凈化，靈敏度高、重現性好，方法學指標滿足殘留監控要求。

四是可操作性強。標準對樣品制備、提取、凈化、色譜條件等各環節均有明確規定，便于實驗室實施。

該標準的實施，為監管部門開展獸藥殘留監測、保障動物性食品安全提供了有力的技術支撐，也為相關檢測實驗室提供了規范的操作依據。