本文隸屬于復(fù)雜制劑應(yīng)用專題，全文共 7638 字，閱讀大約需要 20 分鐘

摘要：不溶性微粒作為藥品中不容忽視的顆粒雜質(zhì)，其來源廣泛，可能在藥品生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲存及使用的多個環(huán)節(jié)混入。進(jìn)入人體血液循環(huán)后，這些不溶性微粒可能會引發(fā)炎癥、肉芽腫、血栓等嚴(yán)重健康問題，甚至可能與腫瘤發(fā)生有關(guān)。疫苗通常通過注射給藥，其中的不溶性微粒會干擾免疫反應(yīng)，進(jìn)而影響疫苗的安全性和有效性。例如，疫苗輔料蔗糖中的不溶性微粒可能引發(fā)速發(fā)型過敏反應(yīng)。各國藥典對不溶性微粒檢測規(guī)定存在差異。《中華人民共和國藥典》（ChP 2025）目前主要針對靜脈注射類制劑，而常見疫苗接種劑型未被覆蓋。美國藥典（USP-NF 2024）則將多數(shù)腸外給藥產(chǎn)品（包括疫苗注射劑）納入檢測，并明確了不同容量規(guī)格注射液的微粒限值。日本藥典和歐洲藥典檢測范圍同樣涵蓋疫苗注射劑。本文列舉了幾種疫苗中不溶性微粒檢測技術(shù)，其中光阻法憑借檢測速度快、操作簡便的優(yōu)勢成為主流，但其易受樣品顏色、濁度和粘性干擾，且無法區(qū)分微粒的性質(zhì)；顯微鏡法雖能直觀觀察微粒形態(tài)等特征，但操作繁瑣、效率低且容易受到主觀因素影響。新興的納米顆粒跟蹤分析（NTA）、掃描電子顯微鏡技術(shù)（SEM）和微流數(shù)字成像（MDI）技術(shù)為檢測提供了新途徑，不過也存在樣品制備復(fù)雜、對小于5μm的顆粒區(qū)分困難等局限。鑒于此，本文結(jié)合各國藥典法規(guī)與技術(shù)方法的對比研究，就優(yōu)化疫苗不溶性微粒檢測體系提出探討。建議在未來修訂過程中，適時參考國際標(biāo)準(zhǔn)，逐步*注射劑檢測范圍，使疫苗注射劑的質(zhì)量監(jiān)測更具針對性，以進(jìn)一步提升疫苗的質(zhì)量管理水平，助力公共衛(wèi)生安全。

關(guān)鍵詞：不溶性微粒；疫苗；藥典法規(guī)；光阻法（LO）；顯微計數(shù)法（MM）；微流數(shù)字成像（MDI）

不溶性微粒是指不溶于輸液、肉眼不可見的非代謝性顆粒雜質(zhì)，粒徑通常小于50μm。其來源廣泛，涉及藥品生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲存及使用等多個環(huán)節(jié)。不溶性微粒對人體健康危害顯著。進(jìn)入人體血液循環(huán)系統(tǒng)后，可能引發(fā)多種不良后果，它能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致靜脈炎、動脈炎等病癥，還可能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生肉芽腫，肉芽腫可出現(xiàn)在肺臟、脾臟、腦、心臟等多個重要臟器，大量肉芽腫的形成會干擾臟器正常功能，嚴(yán)重時危及生命。不溶性微粒會破壞血管壁，促使血小板粘附，進(jìn)而形成血栓，引發(fā)血管栓塞，導(dǎo)致組織壞死、肺損傷、腦梗塞等嚴(yán)重并發(fā)癥。某些情況下，不溶性微粒還可能引發(fā)熱原反應(yīng)，出現(xiàn)高熱、出汗、昏暈、嘔吐等癥狀，嚴(yán)重者甚至休克。部分動物試驗顯示，不溶性微粒與腫瘤和癌癥的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)^[1]。鑒于不溶性微粒的嚴(yán)重危害，對其進(jìn)行檢測十分必要，各國藥典均將注射劑中的不溶性微粒檢查列為必檢項目，通過檢測可有效評估藥品質(zhì)量，及時發(fā)現(xiàn)藥品在生產(chǎn)、儲存和運(yùn)輸過程中引入的不溶性微粒是否超標(biāo)，從而保障患者用藥安全，降低不良反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險。

疫苗是預(yù)防疾病的關(guān)鍵生物制品，疫苗通常通過注射方式進(jìn)入人體，其中的不溶性微粒隨之進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，有引發(fā)危害的風(fēng)險，近年來，疫苗引發(fā)的不良反應(yīng)受到社會關(guān)注^[2]。從免疫反應(yīng)角度來看，有研究結(jié)果表明，疫苗用輔料蔗糖中的不溶性微粒可誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答，導(dǎo)致IgE抗體水平升高和單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP-1）表達(dá)增加，進(jìn)而引發(fā)速發(fā)型過敏反應(yīng)，如蕁麻疹或過敏性休克。疫苗中的不溶性微粒極有可能干擾正常的免疫反應(yīng)，不僅影響疫苗的預(yù)防效果，還可能引發(fā)不良反應(yīng)，降低疫苗的安全性和有效性，建議*疫苗注射劑不溶性微粒的檢測方法和法規(guī)，加強(qiáng)輔料質(zhì)量控制^[3]。

本文旨在分析疫苗中不溶性微粒的檢測現(xiàn)狀及其重要性。通過對比《中華人民共和國藥典》（ChP 2025）、美國藥典（USP-NF 2024）、歐洲藥典（EP 11.0）及日本藥典（JP 18）中關(guān)于不溶性微粒檢測的規(guī)定，探討各國藥典注射劑檢測范圍規(guī)定的異同。此外，本文綜述了光阻法、顯微鏡法、微流數(shù)字成像等檢測技術(shù)的特點(diǎn)與應(yīng)用潛力，提出中國藥典中增設(shè)疫苗不溶性微粒檢測標(biāo)準(zhǔn)的建議，以推動疫苗質(zhì)量控制體系的*，確保患者用藥安全。

根據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》通則<0903>^[4]，中國藥典對不溶性微粒的檢查范圍是：靜脈用注射劑（溶液型注射液、注射用無菌粉末、注射用濃溶液）及供靜脈注射用無菌原料藥中不溶性微粒的大小及數(shù)量。在2025年版《中華人民共和國藥典》通則<0903>中，檢測范圍擴(kuò)展到用于靜脈注射、靜脈滴注、鞘內(nèi)注射、椎管內(nèi)注射的溶液型注射液、注射用無菌粉末及注射用濃溶液，以及供注射用無菌原料藥^[5]。

根據(jù)接種方式，疫苗主要可分為肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射等幾種常見方式^[6]。其中肌肉注射是常見的接種方式，乙肝疫苗、百白破疫苗、狂犬病疫苗等眾多疫苗都采用這種方式接種。皮下注射適用的疫苗包括麻疹疫苗、風(fēng)疹疫苗、腮腺炎疫苗等。皮內(nèi)注射典型的例子是卡介苗。靜脈注射這種方式是將疫苗直接注射到靜脈中，能使疫苗迅速進(jìn)入全身循環(huán)，但由于其直接進(jìn)入血液，風(fēng)險相對較高，在疫苗接種中并不常用。因此，現(xiàn)行中國藥典的不溶性微粒檢測范圍尚未涵蓋肌肉注射、皮下注射等常見疫苗接種方式。但鑒于不溶性微粒對人體健康的潛在危害，未來藥典修訂時應(yīng)考慮將這些疫苗劑型納入不溶性微粒檢測體系為好。

根據(jù)美國藥典USP-1^[7]和USP-NF <788>^[8]，除了4種可豁免劑型外（獸用產(chǎn)品、專門包裝并標(biāo)識為僅用作沖洗液的腸胃外制劑、放射性藥物制劑、給藥前需使用終端過濾器的腸外產(chǎn)品），其余通過腸外給藥產(chǎn)品（包括疫苗注射劑）均需滿足不溶性微粒檢測的要求。

因此，疫苗中的不溶性微粒水平同樣需滿足USP788要求，大容量（＞100mL）注射液中，每 1mL 中≥10μm的微粒數(shù)需＜25粒，≥25μm的微粒數(shù)需＜3粒；小容量（≤100mL）中，每個供試品容器（份）中，≥10μm的微粒數(shù)需＜6000粒，≥25μm的微粒數(shù)需＜600粒。

歐洲藥典并未強(qiáng)制要求疫苗中不溶性微粒檢測。在腸外制劑專章里，雖對注射劑的不溶性微粒檢測（包括亞可見和可見顆粒檢測）作了規(guī)定^[9]，但免疫制劑類疫苗并未在其范圍之內(nèi)。在疫苗相關(guān)專章和中，也未提及不溶性微粒檢測相關(guān)內(nèi)容^[10]。

日本藥典要求，除另有規(guī)定外，注射劑和制劑的載體需要符合JP<6.07>或JP<6.17>的要求^[11]。根據(jù)日本藥典對注射劑的定義，注射劑是無菌制劑，通過皮膚、肌肉或血管直接注入體內(nèi)，通常為活性物質(zhì)(一種或多種)的溶液、懸液或乳劑形式，或含有活性物質(zhì)(一種或多種)并在使用前溶解或懸浮的固體形式。因此，疫苗作為注射劑類產(chǎn)品，理應(yīng)滿足該藥典規(guī)定的檢定標(biāo)準(zhǔn)^[12]。

表1 不同藥典中對不溶性微粒檢測范圍的規(guī)定

光阻法（Light Obscuration，LO）是目前各國藥典檢測不溶性微粒的主要方法之一，其原理是當(dāng)液體中的微粒通過一窄小的檢測區(qū)時，與液體流向垂直的入射光，因被微粒阻擋而減弱，由此產(chǎn)生的電信號變化經(jīng)儀器處理后可測定微粒的大小和數(shù)量。該法優(yōu)點(diǎn)是檢測速度快、操作相對簡便，能對大量樣品進(jìn)行快速檢測，缺點(diǎn)是對于一些有顏色（如藍(lán)色，因為光阻法的激光光源多為紅光光源）會影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，且無法區(qū)分微粒的性質(zhì)，對于粘性較大的樣品需要稀釋后進(jìn)行測試（確保測試過程無抽空，無顆粒間的重疊）。

顯微鏡法（Microscopy Method，MM）是藥典收錄的不溶性微粒檢測方法。通過將供試品過濾，在顯微鏡下觀察并計數(shù)濾膜上的微粒，以此確定供試品中不溶性微粒的數(shù)量和大小，顯微鏡法的優(yōu)點(diǎn)是可以直接觀察微粒的形態(tài)、大小和數(shù)量，能直觀地判斷微粒的性質(zhì)；缺點(diǎn)是檢測過程較為繁瑣、耗時，操作員每天在使用設(shè)備之前需要用NIST可溯源的千分尺對儀器進(jìn)行調(diào)焦和校驗，，且顯微計數(shù)法不適用于高粘性產(chǎn)品、易在空氣中變化的產(chǎn)品，易通過濾膜（如含硅油顆粒等特殊成分）的產(chǎn)品也不適用，這類產(chǎn)品微粒難以被有效截留，會導(dǎo)致檢測結(jié)果失準(zhǔn)，還不適用于尺寸過小、透明度極低、過厚、表面不平整、處于動態(tài)變化、有特殊環(huán)境要求以及的樣品。

且該方法受操作人員的技術(shù)水平影響較大，不適用于大量樣品的快速檢測。如顯微鏡法專章 USP<1788.2>明確規(guī)定，操作人員對顯微鏡的熟練運(yùn)用是確保膜顯微鏡法有效實施的關(guān)鍵，在培訓(xùn)過程中，操作人員需借助標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)展開系統(tǒng)的實操訓(xùn)練。具體而言，操作者和培訓(xùn)人員要針對同一標(biāo)準(zhǔn)樣本分別進(jìn)行三次獨(dú)立檢測，且每次檢測結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）必須控制在≤5%，不同操作者之間的RSD差異也應(yīng)保持在≤10%。且顯微鏡法的準(zhǔn)確性在很大程度上取決于操作者對粒子尺寸的主觀判斷。在實際操作中，當(dāng)需要區(qū)分接近閾值（如9μm與10μm）的顆粒時，光學(xué)衍射效應(yīng)、背景干擾以及操作人員的疲勞等因素，都極有可能引發(fā)顯著誤差，這意味著即使經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)，操作人員在面對復(fù)雜樣本時，仍可能因各種客觀和主觀因素影響，導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差。此外，對于高顆粒負(fù)載的樣本（例如每膜含有≥3000個顆粒），若采用完整計數(shù)法，所需時間會超過1小時，檢測效率較低^[13]。

綜上所述，顯微鏡法鑒于其對操作人員專業(yè)素質(zhì)的高要求、檢測效率的限制，以及主觀判讀過程中難以避免的誤差，面臨著合規(guī)風(fēng)險與成本壓力。因此，光阻法因其高效、準(zhǔn)確和自動化程度高，逐漸成為不溶性微粒檢測的方法^[14]。各國藥典光阻法、顯微鏡法也在逐步更新。如下匯總了中國藥典及美國藥典不溶性微粒檢測方法的演變歷史。表格如下：

表2  美國藥典不溶性微粒檢測方案歷史演變

表3  中國藥典不溶性微粒檢測方案歷史演變

通過中、美藥典對于不溶性微粒檢測方法的方法的演變史，可以看到，對于不溶性微粒的檢測方法的理解在不斷深入和優(yōu)化。1985年版USP788更新，在原有顯微鏡法的基礎(chǔ)上，增加了光阻法，隨后將其列為一法，USP788中光阻法作為方法，適用于大多數(shù)常規(guī)注射劑，顯微計數(shù)法作為二法，適用于特殊劑型，如乳劑、脂質(zhì)體，或在光阻法不適用時作為補(bǔ)充方法。2000年中國藥典CP0903中也新增了光阻法這一檢測方法學(xué)^[15]。2004年，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院對4種輸液樣品分別進(jìn)行了光阻法和顯微鏡法的對比研究，檢測每毫升中直徑≥10 μm和≥25 μm的微粒數(shù)。研究結(jié)果表明，光阻法與顯微鏡法的實驗數(shù)據(jù)無顯著性差異，而光阻法在智能化程度和操作簡便性上優(yōu)于顯微鏡法，逐步取代了傳統(tǒng)的人工檢測方法^[14]。次年（2005年），中國藥典將光阻法列為一法，顯微鏡法列為第二法，與國際標(biāo)淮接軌，一直沿用至今。

蘭州生物制品研究所的一項研究中^[16]，為評價口服三價重配輪狀病毒減毒活疫苗( Vero 細(xì)胞) 的運(yùn)輸穩(wěn)定性，以蘭州市至廣西壯族自治區(qū)公路運(yùn)輸路線來模擬疫苗運(yùn)輸過程的最差條件，進(jìn)行一次往返運(yùn)輸，用溫度及溫度循環(huán)等破壞性試驗來模擬疫苗脫冷鏈后在條件下的情況，通過檢測外觀、pH、滲透壓、裝量、不溶性微粒、重金屬、病毒滴度、異常毒性等項目來考察疫苗溫度偏移穩(wěn)定性。其中不溶性微粒項目，依據(jù)《中華人民共和國藥典》2020 版（三部）物理檢查法使用光阻法進(jìn)行檢測。

蘭州生物制品研究所另一項研究中，同樣使用了光阻法進(jìn)行不溶性微粒檢測^[17]，考察不同組合的內(nèi)包裝材料對 Hib 結(jié)合疫苗的影響。通過設(shè)計不同組合實驗，選出適合的包裝材料。實驗過程中對所選藥品包裝材料按照生產(chǎn)廠家的不同來搭配，共得到 12 種組合，根據(jù)相容性試驗設(shè)計，將樣品置于 25 ± 2℃ 環(huán)境下，分別在1、2、3、6 個月時取樣，進(jìn)行pH值、內(nèi)毒素、不溶性微粒3 個項目的檢測，其中不溶性微粒項目參照藥典標(biāo)準(zhǔn)，對微粒直徑(≥10 μm) 和(≥25 μm) 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。再對三種檢測指標(biāo)綜合比較得出優(yōu)組合，對 Hib 結(jié)合疫苗的影響最小。實驗中的pH 值、內(nèi)毒素含量和不溶性微粒這3個試驗項目分別反映了該疫苗的化學(xué)、生物和物理3類指標(biāo)，能客觀地示不同組合的包裝材對疫苗質(zhì)量的潛在影響。

王玨等人的一項研究中，通過建立小鼠腘窩淋巴結(jié)模型，對疫苗用輔料蔗糖中不溶性微粒激發(fā)免疫應(yīng)答風(fēng)險進(jìn)行了初步評估^[3]，該項研究從蔗糖樣品中濾去蔗糖提取濃縮液，制得不溶性顆粒物樣品，采用納米顆粒跟蹤分析儀測定粒徑及其分布，采用全自動掃描電子顯微鏡觀察其顆粒形態(tài)，微粒粒徑為100～300 nm，不同廠家蔗糖的不溶性微粒在大小和數(shù)量上均存在差異，采用小鼠腘窩淋巴結(jié)模型對蔗糖中不溶性微粒激發(fā)免疫應(yīng)答風(fēng)險進(jìn)行評估，結(jié)果表明蔗糖中不溶性微粒存在引發(fā)速發(fā)型過敏反應(yīng)并誘導(dǎo) Th2 免疫反應(yīng)的風(fēng)險，也能直接作用于脾淋巴細(xì)胞，提高其增殖能力，不同廠家的蔗糖產(chǎn)品顯示出對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖不同程度的影響，作用程度與產(chǎn)品中不溶性微粒的數(shù)目有關(guān)。研究中采用的納米顆粒跟蹤分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）技術(shù)，是一種基于光散射原理的單顆粒檢測技術(shù)，激光照射使微粒散射光，相機(jī)捕捉散射光并跟蹤微粒運(yùn)動軌跡，利用斯托克斯-愛因斯坦方程計算粒徑，不僅能測量粒徑分布，還可得到顆粒濃度信息；而掃描電子顯微鏡技術(shù)（Scanning Electron Microscopy，SEM）是利用電子束掃描樣品表面，激發(fā)出二次電子、背散射電子等信號，再將這些信號轉(zhuǎn)化為圖像，能觀察到不溶性微粒的形態(tài)、大小、分布等特征。

Grant E. Frahm等人研究了微流數(shù)字成像（Microflow Digital Imaging，MDI）技術(shù)在含不透明疫苗佐劑的制劑中評估亞可見顆粒的能力^[18]，制備了一種混合溶液模擬含佐劑疫苗的實際情況，還對一種流感疫苗進(jìn)行了檢測，分別評估了不含佐劑以及含有50%過濾后AddaVax™（體積比）的流感疫苗中的亞可見顆粒。微流數(shù)字成像技術(shù)通過讓顆粒在流動池中流動并進(jìn)行數(shù)字成像來分析顆粒，能評估2 - 80μm的亞可見聚集體，對透明顆粒靈敏度高，還可區(qū)分顆粒亞群，但存在局限性，如高濃度佐劑會影響PS顆粒測量，對部分顆粒計數(shù)有偏差，且受儀器分辨率限制，無法區(qū)分小于5μm的顆粒類型。

疫苗作為預(yù)防疾病的核心生物制品，其安全性與有效性直接關(guān)乎公眾健康。然而當(dāng)前《中華人民共和國藥典》（ChP 2025）對不溶性微粒的檢測范圍仍局限于靜脈注射類制劑，未覆蓋肌肉注射、皮下注射等主流疫苗接種方式。蘭州生物制品研究所在圍繞疫苗的不溶性微粒開展了較多的研究工作。其中，在對疫苗的運(yùn)輸穩(wěn)定性進(jìn)行評估時，參考ChP 2020<9402>《生物制品穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則》^[19]，將不溶性微粒作為檢驗運(yùn)輸前后疫苗產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)，另外，在考察內(nèi)包裝材料對疫苗影響時，也將不溶性微粒作為一項重要指標(biāo)，且參考標(biāo)準(zhǔn)都是ChP 2020<0903>不溶性微粒檢測專章，說明雖然藥典沒有強(qiáng)制要求疫苗檢測不溶性微粒，但在實際疫苗研發(fā)、生產(chǎn)與質(zhì)量控制中，業(yè)內(nèi)已開始重視不溶性微粒這一指標(biāo)對疫苗質(zhì)量的影響。另外，通過這些研究，發(fā)現(xiàn)圍繞疫苗的不同環(huán)節(jié)（諸如運(yùn)輸、存儲等）不溶性微粒指標(biāo)差異大，且對最終產(chǎn)品的品質(zhì)有著巨大的影響。因此，對疫苗中潛在的不溶性微粒風(fēng)險的監(jiān)控是很有意義和必要的。

因此，在未來的修訂中，中國藥典可考慮進(jìn)一步拓展不溶性微粒檢測的適用范圍，將肌肉注射、皮下注射等疫苗納入檢測體系，并參考國際標(biāo)準(zhǔn)，如美國藥典（USP-NF 2024），結(jié)合光阻法、顯微計數(shù)法等技術(shù)，以優(yōu)化疫苗不溶性微粒的檢測方法。此外，加強(qiáng)對疫苗輔料中不溶性微粒的源頭控制，也將有助于提升疫苗生產(chǎn)全流程的質(zhì)量保障。也有助于提升疫苗生產(chǎn)的整體質(zhì)量水平及質(zhì)量穩(wěn)定性。