1.眼部新生血管疾病中VEGF上調與炎癥的關系

研究人員通過觀察外周血中VEGF和炎性細胞因子的上調，開始認識到血管生成和炎癥在眼部新生血管疾病中的潛在雙重功能。CNV和RNV患者房水中VEGF和炎性細胞因子的上調，然而，它們之間的關系主要在小型人群中中得到正式檢查。因此，作者從大量患者中收集房水樣本CNV（n=53；補充表1），RNV（n=52；補充表2）和對照受試者（n=50；補充表3），并使用CBA檢測技術來量化VEGF和其他促炎細胞因子（圖1a和補充圖1a）。如圖1b所示，CNV患者的VEGF表達比健康對照組高3倍。CNV患者的主要促炎細胞因子白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子（TNF），均分別上調3倍，10倍和3倍（圖1b）。如報告所述，IL-6炎性細胞因子可誘導VEGF的產生。此外，作者觀察到促炎性細胞因子水平與VEGF之間存在強正相關（圖1c和補充圖2a）；平均黃斑厚度（MMT）與VEGF和促炎細胞因子IL-6和IL-1β相關（圖1c和補充圖2a）。RNV患者表現(xiàn)出類似的促炎細胞因子上調，并與MMT相關（補充圖。1b、c和2b）。這些結果不僅證實了先前關于VEGF和促炎細胞因子在眼部新生血管疾病中異常上調的報道，而且還揭示了VEGF介導的眼部新生血管與炎癥之間的關聯(lián)，其中IL-6和IL-1β可能在這些疾病的發(fā)病機制中起重要作用。為了研究眼部新生血管的組織病理學，作者使用了臨床前小鼠和非人靈長類CNV模型，該模型由眼底激光光凝誘導（圖1d和補充圖3）。

作者檢測到CNV誘導的小鼠房水中VEGF（約3倍）和促炎細胞因子IL-6（20倍）、IL-1β（3.5倍）和TNF（3.5倍）顯著增加（圖1e），食蟹猴模型中也有類似的失調（補充圖4）。此外，作者分析了CNV誘導的小鼠脈絡膜組織中的新生血管病變。激光光凝誘導新生血管形成，內皮素（CD105）表達，但在對照組小鼠中很少有相關變化（圖1f）。CD105⁺血管有大量的VEGF生成并富集，被大量F4/80⁺巨噬細胞包圍，這表明VEGF上調和浸潤的免疫細胞在促進眼部新生血管形成中的協(xié)調作用。此外，作者在CNV新生血管病變周圍檢測到MMP2和MMP9的大量表達；在對照組的小鼠中未觀察到相應變化（圖1g）。這種MMP的高表達，可能是由浸潤的巨噬細胞產生，MMP將重塑細胞外基質，從而促進免疫細胞浸潤和血管生成。從CNV患者和臨床前動物模型的結果表明，VEGF和炎癥之間的協(xié)同作用促進了眼部新生血管疾病。

2.可切割的aV與工程化rREX的耦合連接

研究結果表明，針對眼部血管疾病采用靶向VEGF和炎癥的的聯(lián)合治療策略更加可行。CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg細胞是維持免疫耐受和控制炎癥的主要的潛在機制。眼內細胞，特別是色素上皮細胞，具有調節(jié)特性，可誘導眼內Treg細胞的產生，防止炎癥和維持眼免疫赦免。但由于玻璃體腔內注射Treg細胞并通過炎癥介導的免疫調節(jié)轉化為其他T細胞類型，對視力有不良影響，因此這種方法不適用于眼血管疾病的治療。Treg衍生的外泌體是一類由Treg細胞內源性分泌的脂質雙層囊泡（直徑為30–150nm），具有良好的生物相容性、低細胞毒性、免疫惰性和特異靶向性。Treg衍生的外泌體表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，有可能作為成品用于急性環(huán)境，而細胞需要很長時間才能分離和生長。為了產生REX，在標準分化條件下，將原始CD4⁺T細胞極化以誘導Treg細胞7天（補充圖5），并使用超速離心法從培養(yǎng)上清中分離外泌體。

作者設計了一種雙靶向策略，將aV與cL（Arg-Val-Gly-Leu-Pro）結合到rEXS上，cL可被MMPs切割（補充圖6）。通過將N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）和6-馬來酰亞胺引入連接體的兩端來實現(xiàn)共軛，連接體分別與aV中的氨基和rEXS上的巰基反應。結果表明，納米藥物rEXS–cL–aV有望通過aV阻斷VEGF活性和rEXS減輕炎癥，從而最大限度地發(fā)揮協(xié)同效應。結果表明，rEXS上的趨化因子受體可通過炎性趨化因子的梯度增強該納米藥物在新生血管病變中的積累，一旦納米藥物接近新生血管病變，MMP的存在可切割連接物并釋放aV以達到局部高濃度（圖2a）。

透射電子顯微鏡（TEM）顯示rEXS-cL-aV典型的杯狀外泌體形態(tài)，平均直徑約為120nm（圖2b）。通過二級免疫抗體金納米顆粒的結合驗證了aV在rEXS表面的成功偶聯(lián)（圖2c），偶聯(lián)密度可達每rEXS約10個aV分子。進一步支持成功修飾的是，aV信號在共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）和插入的受激發(fā)射耗盡（STED）圖像中與rEXS信號高度共域（圖2d），rEXS-cl-aV的尺寸略有增大，ζ電位略有降低（與rEXS相比）（圖2e）。免疫印跡進一步驗證了rEXS-cL-aV上存在外泌體標記物（CD9、CD47、ALIX和TSG101）、趨化因子受體（CCR6）、Treg免疫抑制蛋白（IL-10和CTLA-4）和偶聯(lián)aV（圖2f和Supplementary Fig 7）。這幾乎被MMP9抑制劑GM6001*抑制（圖2g）。被釋放的aV也顯示了類似與VEGF的結合能力，表明aV的偶聯(lián)和釋放循環(huán)并不影響其中和能力（圖2h）。最后，rEXS-cL-aV顯示出了可靠的穩(wěn)定性，在4°C磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中儲存（圖2i和補充圖8）或凍干和復溶（圖2j）后，沒有檢測到粒徑和ζ電位的變化。這些結果驗證了工程化rEXS-cL-aV具有理想穩(wěn)定性特征可用于疾病的治療。

3.rEXS-cL-aV在體外對CECs遷移和存活的雙重抑制以及對巨噬細胞的促炎分化作用

作者建立了一個Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)來測試rEXS–cL–aV在抑制CNV相關血管生成和炎癥中的作用。將原代脈絡膜內皮細胞（CEC）培養(yǎng)在頂腔中以模擬血管生成，并將經脂多糖（LPS）預處理以極化為促炎1型巨噬細胞（M1）的原代巨噬細胞接種在下腔中以模擬炎癥微環(huán)境。對CEC遷移的評估表明，與PBS或nEXS相比，rEXS、aV或rEXS–fL–aV處理的CEC遷移減少，而rEXS–cL–aV處理的CEC遷移受到強烈抑制（圖3b和補充圖9）。值得注意的是，rEXS–cL–aV在誘導CEC死亡方面更有效，其效率分別比rEXS–fL–aV、aV和rEXS高出約2倍、3倍和6倍（圖3c）。CLSM分析顯示所有類型的外泌體都被巨噬細胞吞噬。

rEXS–fL–aV治療導致巨噬細胞內aV的消耗，如巨噬細胞內aV和rEXS的共同染色所示；然而，在用rEXS–cL–aV治療的巨噬細胞中很少觀察到這種情況（圖3d和補充圖10）。這表明作者設計的可切割連接物可以減少巨噬細胞中aV的消耗，并提高其對CEC的生物利用度。此外，作者還檢測了培養(yǎng)上清液中VEGF和炎性細胞因子的產生。用aV（aV、rEXS–fL–aV或rEXS–cL–aV）治療可有效降低可溶性VEGF濃度，而用rEXS（rEXS、rEXS–fL–aV或rEXS–cL–aV）治療可有效降低IL-6、IL-1β和TNF的產生（圖3f）。總體而言，rEXS–cL–aV優(yōu)于rEXS–fL–aV，并且在抑制炎癥方面比其他治療方法表現(xiàn)出更高的效率。這一結果得到了其對巨噬細胞中CD86上調進行抑制的支持（圖3e和補充圖11）。

4.在激光誘導的CNV小鼠模型中，眼內滯留、CNV損傷靶向和rEXS–cL–aV的時空耦合釋放

作者在激光誘導的CNV小鼠模型中評估了其眼內藥效學（圖4a）。CNV誘導后，玻璃體內注射rEXS和aV（rEXS+aV）、rEXS–fL–aV或rEXS–cL–aV的混合物。使用活體成像進行實時分析，量化aV（用Alexa Fluor 647標記）或rEXS（用DiR標記）在7d內的滯留和眼內分布。在用rEXS+aV治療的小鼠中，玻璃體腔中的熒光aV信號在24h內減少一半以上，在96h內幾乎消失，而rEXS–fL–aV和rEXS–cL–aV的熒光aV信號保留更長時間，注射后4d，信號超過50%或原始水平，注射后7d，信號約為25%（圖4b，c）。aV生物利用度的提高可歸因于外泌體的結合，這表明在玻璃體中消除緩慢。鑒于激光誘導的CNV病變主要位于黃斑部，作者檢測了rEXS熒光信號，并計算了所有治療中的前后比值。然而，三組房室熒光信號的前后比率不同。來自rEXS+aV治療的自由遞送的aV均勻分布，前后比為1，而來自rEXS–cL–aV和rEXS–fL–aV治療的aV顯示為3.5（圖4b，d），表明aV與rEXS的結合促進了其在CNV病變中的積聚。rEXS–cL–aV和rEXS–fL–aV之間的aV信號強度具有平行性，從而支持了控制釋放的假設，并證明在運輸?shù)紺NV病變后部的時間之前，rEXS–cL–aV的aV釋放可以忽略不計。通過分析整個眼球組織切片（補充圖12），也證實了aV信號在整個玻璃體室中的明顯擴散模式。rEXS集中趨向于于CNV病變的能力可能歸因于炎癥病變中趨化因子（如CCL20）的上調以及來自親代Treg細胞的rEXS上趨化因子受體（如CCR6）的表達。

基于上述結果，作者使用四甲基異硫氰酸羅丹明-右旋糖酐作為血管內對比劑和DiO標記的rEXS，在體內使用雙光子熒光顯微鏡檢測CNV病變中活躍新生血管的形成。成像結果顯示rEXS+aV、rEXS–fL–aV和rEXS–cL–aV中的rEXS能夠精確靶向CNV病變中形成的新血管（圖4e）。最后，作者使用CLSM成像分析了眼球組織切片，以檢查納米藥物積聚到CNV病變附近后，rEXS–cL–aV的aV切割情況。與rEXS–fL–aV處理的小鼠眼球組織中aV和rEXS信號的強烈重疊相反，rEXS–cL–aV樣本中的兩個信號之間存在重大偏差（圖4f），這可歸因于由于炎癥病變中MMP水平顯著增加，連接子的有效切割從rEXS–cL–aV釋放aV（補充圖13）。因此，rEXS–cL–aV表現(xiàn)出眼內滯留、CNV病變靶向性和時空控制釋放，表明其潛在的后續(xù)治療效果。

5.rEXS–cL–aV納米藥物在激光誘導CNV小鼠模型中的療效和安全性

作者在激光誘導的CNV小鼠模型中測試了rEXS–cL–aV的治療效果，評估了所有對照組的納米藥物，包括單個部分和rEXS–fL–aV（圖5a）；對脈絡膜新生血管組織進行了轉錄組分析；分析顯示了來自前50個KEGG途徑和基因簇的數(shù)據(jù)。KEGG途徑富集分析顯示，rEXS–cL–aV治療可調節(jié)與免疫調節(jié)（如細胞因子和趨化因子信號通路）和血管生成（如細胞粘附分子和粘著斑通路）相關通路中的基因表達。差異表達基因的分層聚類分析顯示，rEXS–fL–aV和rEXS–cL–aV顯著下調與炎癥相關的基因（例如，Ly6c2、Il2ra、Il1b、Ccl5和Trbc1）。rEXS–fL–aV和rEXS–cL–aV也下調了具有與血管內皮細胞增殖和侵襲相關功能的基因（例如Adam7和Mmp8）（圖5b）。因此，轉錄組學分析支持通過rEXS–fL–aV和rEXS-cL–aV治療炎癥和血管生成的協(xié)同靶向性。此外，與rEXS–fL–aV相比，rEXS–cL–aV治療導致顯著的基因下調，強調了aV反應性釋放在CNV病變中的重要性。因此，與PBS對照組相比，rEXS–cL–aV治療顯著降低了房水VEGF（6倍）、IL-6（12倍）、IL-1β（3倍）和TNF（4.5倍）的水平，并優(yōu)于所有其他對照組（圖5c）。

為了直接評估治療效果，作者使用眼底熒光血管造影（FFA）測量CNV病變中高熒光滲漏部位的數(shù)量和面積。使用rEXS或游離aV的單一療法不足以顯著減少高熒光滲漏。成像顯示，與其他組相比，使用rEXS–cL–aV治療的小鼠表現(xiàn)出高熒光泄漏量最少，平均泄漏數(shù)量減少到1.6。使用rEXS+aV或rEXS–fL–aV的聯(lián)合治療可導致高熒光泄漏部位減少（2-3倍），而rEXS–cL–aV可導致高熒光泄漏部位的顯著減少，可減少8倍（圖5d、g和補充圖14a）。蘇木精-伊紅（H&E）染色rEXS–cL–aV治療導致CNV病變厚度最小，表明CNV病變迅速消退（圖5e，H）。

作者設計的rEXS–cL–aV能夠在CNV病變附近以高濃度聚集，以減輕炎癥，并在炎癥環(huán)境中MMP催化裂解時特異性釋放aV，從而抑制新生血管生成。免疫熒光染色顯示F4/80⁺巨噬細胞和CD105⁺新生血管大量存在于未治療小鼠的CNV病變中（圖5f）。rEXS–cL–aV單藥治療顯著降低巨噬細胞水平；然而，這種治療對新生血管的影響微乎其微。相反，如巨噬細胞水平所示，單獨使用aV治療可抑制新生血管生成，但只能適度控制炎癥。rEXS和aV的三種組合（rEXS+aV、rEXS–fL–aV和rEXS–cL–aV）治療效果顯示，rEXS–cL–aV的治療效果最高。盡管其具有有效的抗血管生成活性，rEXS–cL–aV治療沒有改變眼壓，也沒有顯示改變視網(wǎng)膜形態(tài)的跡象（圖5i，j），支持局部組織的安全性。在系統(tǒng)水平上，rEXS–cL–aV治療不會導致心臟、肝臟、脾臟、肺或腎臟的血液生化標記物或組織學特征發(fā)生任何可檢測的變化，進一步支持玻璃體內給藥的安全性。

6.rEXS–cL–aV在激光誘導的非人靈長類CNV模型中的治療效果

在誘導CNV（每只眼睛中有九個激光點）后，向食蟹猴玻璃體內注射藥物，并在20d后評估療效。對脈絡膜、脈絡膜毛細血管、視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）和光感受器（PR）層進行光學相干斷層成像血管造影（OCTA）圖像分割。成像顯示，與其他組相比，經rEXS–cL–aV治療的食蟹猴色素上皮脫落較少，平均數(shù)量減少至1.25（圖6c，左圖和補充圖14b）。視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）和光感受器（PR）的en face-OCT 圖像顯示了激光損傷點的最小水平尺寸（新形成的血管直徑和水腫程度）（圖6c，中間）。橫截面圖顯示，與其他組相比，使用rEXS–cL–aV治療的猴子顯示出更高的CNV病變分辨率，導致最小的垂直尺寸（病變延伸至視網(wǎng)膜下間隙）（圖6c，右側）。CNV病變水平和垂直尺寸的定量分析證實rEXS–cL–aV在抑制新血管生長方面*（圖6d）。與CNV中的結果相似，在小鼠模型中，rEXS–cL–aV的高效性伴隨著VEGF和促炎細胞因子的顯著降低。相比之下，rEXS單一療法在減輕炎癥方面優(yōu)于aV單一療法，而aV單一療法在降低VEGF方面更有效（圖6e）。

在安全性評估期間，作者使用裂隙燈觀察角膜、前房或晶狀體和眼壓，觀察到在接受或不接受rEXS–cL–aV治療食蟹猴的眼睛各種指標均相似（圖6f）。未經治療和rEXS–cL–aV治療的猴子血液學參數(shù)也相似，并且沒有副作用的跡象（圖6g和補充圖17）。