膀胱癌（BCa）是男性第四常見惡性腫瘤，也是女性常見的惡性腫瘤，復(fù)發(fā)風(fēng)險高。在BCa患者中，約75%為非肌肉浸潤性膀胱癌（NMIBC）。這些患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)（TURBT）后進行膀胱內(nèi)化療或免疫治療。然而30-80%的NMIBC患者在初次手術(shù)治療后5年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)，產(chǎn)生巨大的醫(yī)療費用。研究表明，不良復(fù)發(fā)的原因是TURBT不*，膀胱灌注效率低導(dǎo)致殘留腫瘤持續(xù)或再生。臨床上的膀胱內(nèi)滴注化療藥物，由于在尿液滯留和排泄過程中的周期性稀釋和沖洗，無法在殘留的腫瘤區(qū)域精確地維持持續(xù)有效的藥物濃度。盡管已經(jīng)開發(fā)了合并納米載體和藥物遞送系統(tǒng)以優(yōu)化給藥，但有限的療效和未滿足的安全性（如尿路梗阻和膀胱刺激的風(fēng)險）限制了其臨床應(yīng)用。因此，為準(zhǔn)確和*地殺死殘留的腫瘤，迫切需要智能和安全的膀胱內(nèi)制劑，即使在復(fù)雜的靜脈內(nèi)環(huán)境中也能實現(xiàn)精確的藥物富集和長期釋放。

臨床上，TURBT優(yōu)于膀胱內(nèi)灌注。TURBT手術(shù)床不同于正常的尿路上皮，是殘留腫瘤周圍的特殊環(huán)境。它提供一個現(xiàn)成的特異性靶向平臺，藥物可以定位并直接進入殺死潛在的殘留腫瘤細(xì)胞。雖然靶向手術(shù)床能夠?qū)堄嗄[瘤起到充分的殺傷作用，但膀胱這種pH值和滲透壓不斷變化的復(fù)雜液體環(huán)境，長期穩(wěn)定的靶向作用是其臨床應(yīng)用的主要挑戰(zhàn)。由于失去了皮膚等表層屏障的保護，細(xì)菌感染更容易發(fā)生在手術(shù)或燒傷等傷口上。細(xì)菌感染對傷口的偏好可能為解決手術(shù)床定位問題提供新的思路。細(xì)菌感染由與宿主細(xì)胞的黏附引起，宿主細(xì)胞上的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）包括纖連蛋白（FN）、膠原蛋白、層粘連蛋白等通過細(xì)菌表面上的一組特定ECM附著分子為細(xì)菌直接黏附提供天然和多分子成分。在外部屏障被破壞后，損傷可能會暴露更多的ECM成分，從而增加穩(wěn)定細(xì)菌黏附的機會（方案1a）。卡介苗（BCG）是一種活的、減毒的牛分枝桿菌菌株，它可以通過手術(shù)特異性粘附于破壞的尿路上皮而不在正常的尿路上皮表面附著，這啟發(fā)作者實現(xiàn)膀胱手術(shù)床的特異性靶向。有文獻表明BCG特異性附著是由兩種成分介導(dǎo)的：BCG表面FN附著蛋白的FN結(jié)合肽（FBP）和TURBT手術(shù)暴露在手術(shù)床上的FN。

多肽除了具有生物相容性外還具有結(jié)構(gòu)和生物活性，是一種理想的生物材料。對多肽自組裝特性的研究不僅揭示了從納米粒子、納米纖維到納米網(wǎng)絡(luò)的一系列形態(tài)，而且拓寬了其在生物體中的應(yīng)用。作者代表性研究表明一系列自組裝肽可以在實體瘤中原位特異而牢固地形成3D纖維網(wǎng)絡(luò)，具有高蓄積性和長期滯留，用于歸巢治療藥物、抑制轉(zhuǎn)移等。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，自組裝肽基材料有望構(gòu)建理想的藥物遞送系統(tǒng)，即使在流動和沖洗的膀胱內(nèi)環(huán)境中，該系統(tǒng)也能在殘留腫瘤部位精確分布并延長滯留時間。

受細(xì)菌衍生的FN結(jié)合肽和暴露的FN之間的分子識別，特異性細(xì)菌粘附到傷口的啟發(fā)，作者將這種肽引入自組裝肽系統(tǒng)，并開發(fā)了細(xì)菌啟發(fā)的可轉(zhuǎn)化納米粒子（BTN）。BTN肽由三個基序組成：（1）FN結(jié)合肽（GNRQRWFVVWLG）作為靶向基序，（2）氫鍵肽（KLVFF）作為自組裝基序，（3）十二烷基鏈作為疏水基序（方案1b）。最初，BTN肽可以自組裝成納米BTN，并包裹阿霉素（DOX）以獲得具有十二烷基和KLVFF基序疏水核心的DOX@BTN。DOX@BTN的工作原理如方案1c所示。（1）細(xì)菌引起的粘連：首先將DOX@BTN膀胱內(nèi)給藥，并在術(shù)后手術(shù)部位暴露FN。DOX@BTN在FN結(jié)合肽的引導(dǎo)下精確靶向暴露的FN，從而附著在殘留腫瘤上。（2）轉(zhuǎn)化和藥物濃縮：疏水核心限制KLVFF堆疊在一起并形成組織良好的分子間氫鍵。一旦與靶標(biāo)FN結(jié)合，BTN的配體與FN之間的結(jié)合力就打破了BTN疏水親水平衡的限制，啟動了氫鍵肽之間的分子間氫鍵作用。因此，BTN從納米顆粒轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂?beta;-折疊二級結(jié)構(gòu)的納米纖維（NFs），進一步形成覆蓋殘留腫瘤的纖維涂層。NFs中的疏水域很容易通過疏水和π-π相互作用捕獲和儲存DOX，從而豐富手術(shù)部位中的化療藥物。DOX@BTN確保DOX的精確富集和延長釋放，不受周期性排尿的影響，直接有效地殺死殘留的膀胱癌細(xì)胞并減少膀胱癌的復(fù)發(fā)（方案1c）。

根據(jù)固相多肽合成方法（圖S1），作者合成了FN可靶向和可轉(zhuǎn)化的C12-KLVFF-GNRQRW-FVVWLG型BTN多肽，以及兩個對照肽C1-BTN多肽（C12-KLVFF-GVRLWVQFRNWG）和C2-BTN多肽（C12-KAAGG-GNRQRWFVVWLG）。C1-BTN肽含有FN結(jié)合肽的自組裝基序，但不是靶向的擾亂序列。C2-BTN多肽具有FN靶向基序，但缺乏自組裝序列。因此，C1-BTN和C2-BTN都被設(shè)計成不能轉(zhuǎn)化為纖維結(jié)構(gòu)。采用快速沉淀法制備納米BTN和對照BTN（40μM，H₂O:DMSO = 99:1，v/v）。作者嘗試探索包括FN結(jié)合肽的BTN是否保留了特定的FN靶向能力。從黏附陣列（圖1A）可以發(fā)現(xiàn)BTN和C2-BTN對預(yù)包覆的FN層的結(jié)合能力分別是C1-BTN（擾亂靶向序列）的2.7和2.4倍，表明FN結(jié)合肽賦予納米FN靶向能力。BTN與FN的結(jié)合能力分別是牛血清白蛋白（BSA）、膠原和層粘連蛋白的4.3、3.0和3.6倍，表明BTN具有與FN的特異性結(jié)合能力。另外通過分子動力學(xué)模擬預(yù)測了BTN在FN內(nèi)的結(jié)合域。FN的第13型結(jié)構(gòu)域（即FNIII13）在所選的FN結(jié)構(gòu)域（FN的7-10、11、12、13和14-16型結(jié)構(gòu)域）中范德華和庫侖相互作用能最大，表明BTN與FNIII13結(jié)合較強（圖S2）。然后，根據(jù)FN結(jié)合肽RWFV序列中結(jié)合能低、活性位點最多的位點，通過分子對接，篩選出較好的蛋白肽結(jié)合模型（即FNIII13-BTN肽）。目標(biāo)基序的VWLG序列與FN的T11，K19，I20，Y22，E23，E53，D55，A57之間發(fā)生了大的疏水相互作用（圖1b）。BTN肽和FN通過分子對接的代表性結(jié)合結(jié)構(gòu)，這種結(jié)合引發(fā)了BTN到納米纖維的轉(zhuǎn)化（圖1c）。

作者進一步研究了BTN向NFs的轉(zhuǎn)化以及相應(yīng)的體外生物保留能力。將MCSs與Cy5標(biāo)記的BTN和C2-BTN共同孵育6h，分別于第0、1、2、3、4、5天觀察，每次觀察前更換MCSs的培養(yǎng)液。如圖2e和圖2f所示，在Cy5標(biāo)記的BTN和C2-BTN組中，在第一個時間點都檢測到比較熒光。C2-BTN組第二天熒光信號急劇衰減，第三天出現(xiàn)微弱的熒光信號，相比之下BTN處理的MCSs顯示出長期的熒光信號。第5天BTN組的剩余熒光強度仍達到初始熒光強度的60.1%，幾乎是C2-BTN組的兩倍（圖2e，f）。這種長時間的熒光可能是因為BTN轉(zhuǎn)化成的NFs型，它牢固地附著在MCSs上，耐洗滌并長期保留。為了驗證BTN的牢固附著，使用掃描電子顯微鏡（SEM）直接觀察經(jīng)BTN處理1h后的MCSs表面。在MCSs上觀察到纏繞的纖維網(wǎng)絡(luò)，可能是來自BTN的交織的NFs，驗證了牢固的附著。相比之下C2-BTN處理的MCS的表面呈現(xiàn)出相對光滑的外觀，表明C2-BTN在培養(yǎng)基更換期間被洗去（圖2g）。經(jīng)Cy5標(biāo)記BTN處理的L929 MCSs用ThT進行染色，CLSM圖像不僅顯示ThT在480 nm處的綠色發(fā)射熒光增強，而且與Cy5的紅色熒光共域，Pearson相關(guān)系數(shù)（PCC）為0.77，提示MCSs中具有β折疊結(jié)構(gòu)的NFs（圖2h）。C2-BTN組的ThT熒光顯示較低的PCC（0.56），Cy5標(biāo)記的C2-BTN熒光呈紅色，表明C2-BTN的β折疊結(jié)構(gòu)較少。綜上所述，這些結(jié)果表明BTN可在細(xì)胞微環(huán)境中與FN牢固結(jié)合，并在MCSs上自組裝成具有β折疊結(jié)構(gòu)的相互交織的NFs，從而延長滯留時間，可作為化療藥物的富集和緩釋庫。

作者使用小鼠原位膀胱模型（n=3）進一步研究了BTN和C2-BTN在膀胱內(nèi)的滯留，該模型提供了具有動態(tài)流體環(huán)境的人類膀胱的真實模擬。將Cy7標(biāo)記的BTN和C2-BTN注入酸蝕的膀胱。膀胱區(qū)的熒光信號以時間依賴的方式被監(jiān)測和量化（圖3e，f）。BTN治療組膀胱內(nèi)熒光信號從4 h開始減弱，但速度相對較慢，在膀胱內(nèi)排尿時表現(xiàn)出較好的抗排尿能力，而C2-BTN組在注射后12 h內(nèi)迅速下降。BTN組在72 h仍可觀察到清晰的BTN熒光信號，而C2-BTN組在42 h后未見明顯的熒光信號。每組的保留效率以起始熒光信號的百分比為指標(biāo)，72 h時BTN組為21.0±5.7%，是C2-BTN組（3.2±0.9%）的6.6倍（圖3e，f）。在心、肺、脾等系統(tǒng)器官中，幾乎沒有熒光信號，表明BTN膀胱內(nèi)灌注的生物安全性（圖S10）。最后，使用Bio-TEM和掃描電子顯微鏡分別驗證了受損膀胱中的纖維涂層和交織纖維涂層（圖3g）。生物顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)BTN組大鼠膀胱內(nèi)壁表面有明顯的纖維結(jié)構(gòu)，而C2-BTN組大鼠膀胱內(nèi)壁表面無明顯纖維結(jié)構(gòu)（圖3h）。相應(yīng)的能量色散光譜（EDS）分析也鑒定了碘標(biāo)記的BTN多肽在纖維結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生的I特征信號（圖S11）。通過掃描電鏡觀察到BTN組擴張性膀胱壁呈纖維狀包膜（圖3i），而在C2-BTN處理的膀胱內(nèi)腔表面無纖維結(jié)構(gòu)，可見少量顆粒狀碎片。在活鼠膀胱中，BTN能精確靶向手術(shù)床自組裝成NFs，牢固地附著在膀胱內(nèi)表面。這些結(jié)果為活體小鼠手術(shù)床中BTN的高積累和長期滯留提供了直接證據(jù)，這對藥物的富集和持續(xù)釋放至關(guān)重要。

為了驗證DOX@BTN具有靶向和長期抗癌作用的*性，使用實時細(xì)胞分析（RTCA）來動態(tài)監(jiān)測DOX@BTN對細(xì)胞活力的影響，同時進行常規(guī)CCK-8檢測（圖S15）。圖4b演示了實驗方法。為提供豐富的靶細(xì)胞（FN）以便更好地轉(zhuǎn)化，在RTCA孔的底部預(yù)涂FN，然后接種膀胱癌細(xì)胞（MB49），*模擬了一個含有癌細(xì)胞殘留的體外傷口。DOX@BTN和游離DOX（臨床傳統(tǒng)治療方式作為對照）在MB49附著生長后添加。1小時后用無DOX培養(yǎng)液更換上清液以模擬尿液沖洗，同時記錄細(xì)胞存活率（圖4b）。兩組細(xì)胞存活率在 4h內(nèi)先略有升高，之后逐漸下降。DOX@BTN組的下降速度明顯快于游離DOX組。在72 h時，DOX@BTN對細(xì)胞活力的抑制作用明顯強于游離DOX（圖4c）。為證實在體外創(chuàng)傷模擬RTCA模型中是否形成了由納米纖維組成的纖維涂層，使用掃描電子顯微鏡觀察了預(yù)涂有FN的RTCA孔上的細(xì)胞（圖4d）。如圖4e所示，在DOX@BTN孵育1 h的細(xì)胞周圍觀察到成簇的纖維涂層，但游離DOX處理1 h后細(xì)胞仍保持黏附，沒有纖維涂層，由于沖刷，細(xì)胞背景清晰。培養(yǎng)上清與DOX或DOX@BTN孵育1 h后更換，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。掃描電鏡顯示DOX@BTN組細(xì)胞被纖維包膜覆蓋，細(xì)胞縮小碎裂，游離DOX組細(xì)胞與1 h時情況相似，背景清晰，無額外結(jié)構(gòu)（圖4e）。這些結(jié)果清楚地證明了在MB49細(xì)胞周圍形成由NFs組成的纖維涂層的證據(jù)，表明DOX@BTN通過與FN結(jié)合靶向并覆蓋MB49細(xì)胞，實現(xiàn)DOX的長期殺傷作用的持續(xù)釋放。

基于在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)交織纖維涂層的高蓄積和長時間滯留，作者測試了纖維交織涂層對DOX的耐尿性和緩釋行為。酸蝕膀胱組灌胃阿霉素，同時灌胃游離阿霉素（0.5 mg/mL，相當(dāng)于920 μM）。收集尿液中釋放的DOX，在不同時間間隔內(nèi)進行測量（圖4f）。尿液中的DOX濃度反映了膀胱內(nèi)的藥物含量。經(jīng)膀胱內(nèi)給藥可使DOX在膀胱內(nèi)定位，直接到達癌灶，發(fā)揮最大的治療效果。如圖4g所示，游離DOX組在16 h內(nèi)快速排泄，導(dǎo)致藥物快速消耗。DOX@BTN組藥物排泄緩慢，24 h后尤為明顯。DOX@BTN處理膀胱排出的DOX濃度顯著高于未處理膀胱排出的DOX濃度。DOX@BTN處理后膀胱72 h釋放的DOX濃度為11.8 μM，仍高于游離DOX的IC50值（1.4 μM），是游離DOX對照組的8.4倍（圖4g，圖S15）。將DOX@BTN和游離DOX分別與電灼傷小鼠的體外膀胱孵育。與游離DOX組相比，DOX@BTN組開放膀胱在靶區(qū)即手術(shù)床上顯示出較強的DOX熒光，證實了手術(shù)床內(nèi)藥物的精確濃縮。DOX@BTN組手術(shù)床上DOX的熒光強度（信號）與正常膀胱壁（噪聲）的比值是游離DOX組的2.2倍（圖S16）。結(jié)果證實DOX@BTN通過與暴露的FN結(jié)合，能夠特異性地靶向手術(shù)床，并有效地保留了DOX在體內(nèi)的長期抗腫瘤作用。

受細(xì)菌對傷口黏附的啟發(fā)，作者成功開發(fā)了一種細(xì)菌誘導(dǎo)的可轉(zhuǎn)化納米顆粒（BTN），用于預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)。負(fù)載藥物的BTN能夠通過細(xì)菌衍生肽（FBP）與暴露的FN結(jié)合，精確地粘附在殘留腫瘤的手術(shù)部位。在靶向FN的引導(dǎo)下，DOX@BTN轉(zhuǎn)化為纖維涂層，具有長期滯留作用，有助于DOX在殘留腫瘤中的持續(xù)釋放，達到精確殺傷的目的。作者建立了不*切除模型來模擬術(shù)后殘留腫瘤。在該模型中，DOX@BTN可明顯抑制腫瘤再生。在原位膀胱癌模型中，DOX@BTN組與傳統(tǒng)膀胱內(nèi)灌注（DOX）相比，復(fù)發(fā)率從71%降低到29%。大多數(shù)注射了DOX@BTN的小鼠至少存活了60天。這種BTN不僅為抑制膀胱癌的復(fù)發(fā)提供了一個全新的視角，而且也是*治愈膀胱癌的*佳臨床替代方案。在臨床實踐中，這種智能配方為管理其他實體腫瘤的復(fù)發(fā)提供了機會。