主要用途

細胞蛋白磷酸酶1（PP1）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在使用使用特異性底物糖原磷酸化酶a，在PP2A抑制劑存在下，受到PP1去磷酸化后，釋放出游離磷酸根，由硫酸亞鐵氨還原產生鉬藍顯色反應后峰值的變化，即采用比色法測定單位酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種細胞裂解懸液樣品包括免疫沉淀復合物和粗提或部分純化酶樣品的蛋白磷酸化酶1活性及其抑制劑的檢測。廣泛應用于細胞凋亡、蛋白組學、病理生理學變等研究。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，反應優化，檢測敏感。

產品內容

清理液（Reagent A）        毫升

裂解液（Reagent B）          毫升

緩沖液（Reagent C）        毫升

陰性液（Reagent D）          毫升

反應液（Reagent E）         微升

顯色液（Reagent F）         毫升

標準液（Reagent G）         微升

產品說明書              1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、緩沖液（Reagent C）、反應液（Reagent E）和顯色液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在4℃冰箱里；顯色液（Reagent F）具有腐蝕性，避免直接用手接觸；有效保證6月

用戶自備

15毫升離心管：用于樣品處理的容器

1.5毫升離心管：用于樣品處理和保存的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于樣品收集

培養箱：用于孵育反應物

平式搖蕩儀：用于混勻反應物

500微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液放進冰槽里融化。然后進行下列操作。

一、 樣品準備

1． 準備好75cm²細胞培養瓶或100mm細胞培養皿的待測培養細胞（5 X 10⁷細胞）

2． 小心加入xx毫升預冷的清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞 

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細胞

6． 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉移到預冷的1.5毫升離心管

11． 強力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

15． 移取2微升進行蛋白定量測定（注意：建議使用 Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、測定準備

1． 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液等），置于冰槽里（注意：樣品須澄清）

2． 設定好分光光度儀或酶標儀（溫度為37℃）：波長為660nm，并置零  

3． 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管

4． 按下表分別加入陰性液（Reagent D）和標準液（Reagent G）到每個離心管，混勻

5． 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

三、 標準曲線測定

1． 移取200微升上述配制的標準液到新的比色皿

2． 在30℃溫度下孵育10分鐘

3． 加入xx微升顯色液（Reagent F），混勻

4． 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照

5． 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數

6． 重復實驗步驟1至5四次

1． 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標（X軸）為標準磷濃度（微摩爾/升）

三、 樣品背景測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升待測樣品（總量100微克細胞裂解萃取液蛋白；作為樣品背景） 

3． 在30℃溫度下孵育10分鐘

4． 加入xx微升陰性液（Reagent D），混勻

5． 加入xx微升顯色液（Reagent F），混勻

6． 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照

7． 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數

8． 根據標準曲線獲得樣品背景對應磷濃度（微摩爾/升）

四、 樣品活性測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升待測樣品（總量100微克細胞裂解萃取液蛋白） 

3． 在30℃溫度下孵育2分鐘

4． 加入xx微升反應液（Reagent E）

5． 在30℃溫度下孵育10分鐘

6． 加入xx微升陰性液（Reagent D），混勻

7． 加入xx微升顯色液（Reagent F），混勻

8． 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照

9． 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數

10． 根據標準曲線獲得樣品活性對應磷濃度（微摩爾/升）

五、 計算樣品活性

七、酶標儀測定

1． 在96孔板上做好相應標記：標準樣品、樣品背景、樣品活性

2． 分別移取100微升上述配制的標準液到相應的標準樣品孔里

3． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到樣品背景和待測樣品孔里

4． 分別加入10微升待測樣品（總量100微克細胞裂解萃取液蛋白）到樣品背景和樣品活性孔里

5． 加入xx微升反應液（Reagent E）到樣品活性孔里

6． 加入xx微升陰性液（Reagent D）到樣品背景孔里

7． 在30℃溫度下，置于平式搖蕩儀孵育10分鐘，速度為50RPM

8． 分別加入xx微升陰性液（Reagent D）到樣品背景和待測樣品孔里

9． 分別加入xx微升顯色液（Reagent F）到所有孔里

10． 在37℃溫度下，置于平式搖蕩儀孵育10分鐘，速度為50RPM，避免光照

11． 即刻放進酶標儀檢測：獲得吸光讀數

12． 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標（X軸）為標準磷濃度（微摩爾/升）

13． 根據標準曲線獲得樣品對應磷濃度（微摩爾/升）

14． 計算樣品活性

注意事項

1． 本產品為25次操作，包括5次（點）標準測定

2． 操作時，須戴手套

3． 系統操作過程中，標準曲線測定只需1條

4． 顯色液（Reagent F）具有腐蝕性，避免直接用手接觸

5． 樣品切忌使用磷酸緩沖液、EDTA、EGTA和脫氧膽酸納處理

6． 比色測定后，比色皿須清洗

7． 如果用戶沒有660nm波長，可以使用600至660nm的任一波長替代

8． 吸光讀數增高，表明具有酶活性

9． 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/20微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量； （本公司提供 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

10． 蛋白磷酸酶1活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.4的情況下，每單位酶在單位時間內（每分鐘）釋放1微摩爾的磷

11． 本公司提供系列磷酸化酶檢測試劑產品