幾項研究表明，長期低劑量甲氨蝶呤（MTX）治療類風濕性關節炎與降低心血管疾病和心血管死亡率有關。MTX 增加一磷酸腺苷（AMP）和5-氨基咪唑-4-羧基酰胺核糖核苷酸（AICAR）的細胞內積累，從而激活 AMP 活化蛋白激酶（AMPK）。AMPK 在促進 YAP Ser127 位點磷酸化中發揮作用，使 YAP 磷酸化以誘導其細胞質定位和蛋白酶體降解，因此，AMPK 的激活導致 YAP 磷酸化和失活。

基于此，在哈爾濱醫科大學附屬第二醫院心內科、心外科以及附屬心肌缺血教育部重點實驗室的一項研究中，假設 AMPK 通路介導 YAP/TAZ 功能失活和 MTX 的動脈粥樣硬化保護作用，實驗評估了 MTX 對動脈粥樣硬化保護作用的貢獻以及對 DF 保護作用的背后信號機制。文章名為《Atheroprotective effects of methotrexate via the inhibition of YAP/TAZ under disturbed flow》。

HUVECs中YAP/TAZ激活和核定位的血流動力學調節

為了研究 YAP/TAZ 在不同剪切力下 HUVECs 中的作用，將培養的 HUVECs 暴露于單向剪切應力（USS）12 dyn/cm2、擾流（DF） 0 ± 4 dyn/cm2 或靜態條件（STA）下 10 小時。通過蛋白質印跡測量了 p-YAP（Ser127）、總 YAP/TAZ 和粘附分子的蛋白質表達水平。結果表明，DF 導致 p-YAP（Ser127）顯著降低和 ICAM1、VCAM1 和 TAZ 表達顯著增加。IF 染色顯示 DF 導致 YAP/TAZ 核定位，而在接受 USS 的 HUVECs 中觀察到增加的 YAP/TAZ 細胞質保留。此外，還通過 IF 檢測了 YAP 磷酸化水平，發現DF顯著降低p-YAP。

DF促進了YAP/TAZ的轉錄活性并顯著增加了YAP/TAZ靶基因CYR61和CTGF的表達。相反，USS 增強了 p-YAP并降低了 YAP/TAZ 靶基因表達。此外，生物力學拉伸介導 HUVECs 募集單核細胞的能力。使用細胞粘附測定，發現在 DF 下附著在 HUVECs 上的 THP1 單核細胞數量增加，這伴隨著粘附分子的上調。
這些結果表明，DF 導致 YAP 去磷酸化和激活，而 USS 導致 YAP 磷酸化和失活。

MTX 磷酸化 AMPK 并減輕 DF 誘導的 HUVECs 中促炎細胞因子的表達

用 MTX（0-100 nM）處理 HUVECs，48 小時后通過蛋白質印跡定量 p-AMPK 水平。結果表明，在靜態條件下培養的 HUVECs 中的 p-AMPK 以劑量依賴性方式增加，最大水平為 100 nM時。該濃度與患者血漿的常規治療低劑量劑量一致。

為了確定 MTX 是否在血流動力學作用下改變促炎細胞因子的表達，使用 qRT-PCR 分析促炎細胞因子基因和 YAP/TAZ 靶基因的水平。在 DF 下觀察到更高水平的IL-6、IL-8、CYR61和CTGF，而不是在 HUVECs 中的 USS，并且 MTX 處理顯著抑制了它們的表達。

為了確定低劑量 MTX 是否誘導 AMPK 下游的變化，檢測了不同流動條件下 p-YAP（Ser127）的蛋白質表達水平。結果表明，DF而非USS導致YAP磷酸化顯著降低。然而，當在 USS 下比較 MTX 處理與對照效果時，沒有觀察到 YAP 磷酸化的顯著變化。MTX處理導致DF或STA下p-YAP表達顯著增加，后者導致MTX處理后p-YAP表達更高。

MTX 抑制 DF 誘導的 YAP/TAZ 活化并發揮動脈粥樣硬化保護作用，而沉默 AMPKα 可逆轉這些作用

接下來探討了 MTX 是否在生物力學拉伸下介導 HUVECs 中的 YAP/TAZ 失活。蛋白質印跡分析顯示，DF 下 MTX 顯著上調 p-YAP 和 p-AMPK 的表達，并顯著降低 ICAM1 和 VCAM1 的水平。還觀察到總 YAP 在細胞質中以高水平組成性表達，并且在 DF 下 MTX（100 nM）處理后單核細胞粘附減少。這些數據表明 MTX 介導 YAP 抑制并減少單核細胞-HUVEC 相互作用，至少部分有助于抗動脈粥樣硬化作用。

因為 YAP 可以被 AMPK 磷酸化，于是進一步探討了 AMPK 在這種 MTX 誘導的保護作用中的作用，并確定 MTX 介導的 YAP 磷酸化是否依賴于 AMPK。siRNA 耗盡 AMPKα促進了 YAP 核轉位，幾乎消除了 MTX 介導的 YAP 磷酸化和 p-YAP 細胞質定位，表明 AMPK 在介導 MTX 誘導的YAP 失活中的關鍵作用。在 HUVECs 中敲低 AMPK 后，DF 下單核細胞粘附蛋白的水平和單核細胞粘附均顯著增加。

沉默 YAP 會降低 DF 下的粘附分子表達

為了進一步證實 YAP 和 DF 誘導的促炎反應之間的關聯，針對 YAP 的 siRNA 被用來檢查 YAP、粘附分子和 AMPK 之間的相互作用。蛋白質印跡結果表明，敲除 YAP 顯著抑制 ICAM1 和 VCAM1 的表達，但不改變 DF 下的 p-AMPK 蛋白水平，表明 AMPK 作用于 YAP 上游，并且 YAP 耗竭可能導致動脈粥樣硬化。

MTX對DF誘導的細胞凋亡和YAP磷酸化的影響

受損的內皮功能包括動脈粥樣硬化的早期階段。實驗采用流式細胞儀檢測 DF 下的細胞凋亡。與 STA 相比，DF 而不是 USS 的應用顯著增加了總細胞凋亡率。然而，用 MTX 治療并沒有減少細胞凋亡。

使用蛋白質印跡分析，檢測到在 DF 下用 MTX 和廣泛使用的動脈粥樣硬化藥物阿托伐他汀處理的 HUVECs 中 p-YAP 表達水平相當。結果表明，在 MTX（100 nM）或阿托伐他?。? μM）存在下細胞暴露于 DF 會導致 YAP 過度磷酸化。MTX和他汀類藥物治療之間的p-YAP表達水平沒有統計學上的顯著差異。

MTX 治療可減少體內 DF 誘導的斑塊形成

為了確定低劑量 MTX 在體內的潛在抗動脈硬化作用，在左頸總動脈周圍放置了一個鑄型以誘導 DF。在暴露于西式飲食 4 周后，在 DF 區域出現了明顯的動脈粥樣硬化病變。YAP/TAZ 染色在動脈粥樣硬化切片的內膜、中層和內膜增生斑塊中顯著。相反，用MTX治療小鼠導致動脈粥樣硬化斑塊和YAP/TAZ的相對表達顯著減少。此外，DF 區域的管腔大于 0.9% 鹽水處理的管腔。

總之，得出結論，MTX 通過 AMP 依賴性激酶（AMPK）-YAP/TAZ 通路發揮保護作用。從治療的角度來看，這些發現提供了對 MTX 賦予動脈粥樣硬化保護機制的見解，并可能有助于開發新的治療方法來限制動脈粥樣硬化。

參考文獻：Liu D, Lv H, Liu Q, Sun Y, Hou S, Zhang L, Yang M, Han B, Wang G, Wang X, Du W, Nie H, Zhang R, Huang X, Hou J, Yu B. Atheroprotective effects of methotrexate via the inhibition of YAP/TAZ under disturbed flow. J Transl Med. 2019 Nov 15;17(1):378. doi: 10.1186/s12967-019-02135-8. PMID: 31730006; PMCID: PMC6857284.

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