椎間盤（IVD）是連結相鄰兩個椎體的纖維軟骨盤，由3個部分組成：髓核（NP）、纖維環（AF）和軟骨板（CEPs）。NP的退變被認為是椎間盤退變（IVDD）的關鍵步驟。退變的NP變成無組織的纖維組織團塊，細胞外基質（ECM）成分發生改變，主要失去其結合水的能力。退變的NP內的壓力降低，椎間盤高度降低，導致IVDD和脊柱生物力學不穩定。NP在IVDD期間經歷了最高程度的重塑。

大量復雜因素導致椎間盤退化，通常涉及生物力學和生物機制之間的協同相互作用。在它們的相互作用過程中，力學因素、細胞生物代謝反應和水結合ECM在退化中起重要作用。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKT通路控制許多基本的細胞功能，并參與調控轉錄、翻譯、細胞增殖、分化、細胞周期和凋亡。據報道，PI3K/AKT通路參與調節NP細胞增殖、凋亡、衰老和ECM代謝，并且還顯示其與NP變性顯著相關。然而，調控NP退變的機制和生物相互作用機制尚未深入探討。

基于此，山東第一醫科大學附屬頸肩腰腿痛醫院、山東中醫藥大學、河南中醫藥大學第二臨床醫學院、zhong'guo'ren'min'jie'fang'jun第960醫院等研究團隊的一項研究曾探討了循環機械拉伸對NP細胞生物學功能的影響，以及ITGA2/PI3K/AKT通路在響應循環機械拉伸對NP細胞影響中的作用。研究結果可能提供潛在的靶點和逆轉IVDD退行性變化的可能性。

循環機械拉伸促進NP細胞增殖和細胞周期進程

研究首先以0.1 Hz，10% 的拉伸幅度對NP細胞進行8640次循環拉伸應力（ 2秒拉伸，5秒保持，2秒恢復，1秒休息為1個循環），探討了循環機械拉伸對NP細胞生物學功能的影響。結果表明，拉伸應力組NP細胞形狀不規則，生長狀態完整，折光性強。然后評估了循環機械拉伸對NP細胞增殖的影響。如圖1 a，NP細胞在拉伸應力組的生長速度顯著高于對照組。然后，通過流式細胞術分析了循環機械拉伸對細胞周期的影響。拉伸應力組和對照組G1期、S期和G2/M期NP細胞的百分比分別為41.22±5.17% vs 41.71%±2.45%、20.74±2.32% vs 32.47±1.95%、22.27±2.91% vs 15.53±0.78%（圖1 c、d）。與對照組相比，拉伸應力組S期NP細胞百分比顯著降低（圖1 b）。拉伸應力組G2/M期NP細胞百分比顯著高于對照組（圖1 b）。這些結果表明，循環拉伸應力顯著促進了NP細胞從S期向G2/M期的細胞周期轉變。

圖1   循環機械拉伸對NP細胞增殖和細胞周期的影響。

（a） MTS測定顯示，循環機械拉伸促進NP細胞增殖。（b）循環機械拉伸顯著促進了NP細胞從S期向G2/M期的進展。（c）流式細胞術結果顯示對照組中G1，S和G2/M期NP細胞的百分比。（d）流式細胞術結果顯示拉伸應力組中 G1、S 和 G2/M 期 NP 細胞的百分比。

循環機械拉伸抑制NP細胞凋亡

接下來分析了循環機械拉伸對NP細胞凋亡的影響。拉伸組和對照組NP細胞凋亡百分比分別為8.99±0.88%和10.75±0.40%（圖2 a、b）。與對照組相比，拉伸組凋亡NP細胞百分比較低（圖2 c），表明循環機械拉伸抑制了NP細胞的凋亡。

這些結果表明，循環機械拉伸可能通過調節NP細胞的增殖、細胞周期和凋亡來影響NP的退變。綜合以往報道的研究，研究結果表明，高機械拉伸可能會促進NP細胞凋亡和變性，而適度的機械拉伸可能會抑制NP細胞凋亡，促進NP細胞增殖，并可能改善NP變性。

圖2   循環機械拉伸對NP細胞凋亡的影響。

（a）通過流式細胞術分析的對照組中凋亡NP細胞的百分比。（b）通過流式細胞術分析的拉伸應力組中凋亡NP細胞的百分比。（c）循環機械拉伸抑制NP細胞的凋亡。

循環機械拉伸刺激 NP 細胞中的差異表達基因

為了闡明循環機械拉伸影響NP細胞的機制，進行了微陣列分析以檢查響應循環機械拉伸的效應基因。結果顯示，拉伸組與對照組共有689個候選基因表達存在顯著差異，其中333個基因表達上調，356個基因表達下調。

然后進行了GO功能注釋，該分析由三個主要分支組成，即生物過程（BP），分子功能（MF）和細胞組成（CC）。結果顯示，BP類主要基因為基因表達、細胞增殖分裂、凋亡過程的正向調控，MF類基因以ECM結構成分為主，CC類包括粘附斑和ECM。NP細胞增殖、凋亡和ECM代謝異常已被證明會導致NP變性。微陣列結果顯示，參與這些生物學功能和過程的具有顯著差異表達的基因與NP變性密切相關。

此外，還基于KEGG數據庫分析了與信號通路相關的所有差異表達基因（DEG）的參與情況。在與循環機械拉伸刺激相關的shi'da富集信號通路中通路PI3K/AKT。據報道，PI3K/AKT通路參與NP細胞凋亡、衰老和ECM降解的調節，與NP變性顯著相關。基于上述實驗結果，PI3K/AKT信號通路可能在循環機械拉伸介導的NP細胞效應中發揮重要作用。

共發現31個參與PI3K/AKT信號通路的基因，在兩組之間的表達存在顯著差異。其中，18個基因是該通路的陽性效應子，顯著上調。相反，13個負向調節該通路的基因，明顯下調。因此進一步進行了qRT-PCR以確認微陣列結果。結果顯示，與對照組相比，拉伸組NP細胞中ITGA2、FGF1、COL2A1和BCL2L11的mRNA水平顯著升高，MYC和IL7R mRNA水平明顯降低。這些結果進一步支持了從微陣列數據中得到的發現。

ITGA2/PI3K/AKT 通路參與循環機械拉伸介導的對 NP 細胞的影響

整合素被廣泛認為是IVD細胞機械轉導過程中的主要機械感受器。整合素通路在脊索細胞對機械負荷誘導的IVDD的易感性中起重要作用。ITGA2，也稱為整合素A2，編碼膠原蛋白和其他相關蛋白質的跨膜受體的α亞基。整合素α2β1參與雌激素干預的PI3K/AKT通路，調節椎間盤老化和變性的抗凋亡作用，參與FAK/PI3K信號傳導，調節IVD變性中NP細胞的粘附能力和失巢凋亡。然而，ITGA2在循環機械拉伸對NP細胞變性的影響中的作用尚未闡明。

在這項研究中，進行了蛋白質印跡以進一步證實循環機械拉伸對NP細胞中ITGA2 / PI3K / AKT信號傳導過程的影響。蛋白質印跡結果顯示，與對照組相比，拉伸應力組ITGA2和p-AKT蛋白的表達水平顯著高于對照組（圖3 a），表明循環機械拉伸顯著促進了NP細胞中的ITGA2/PI3K/AKT信號通路。

為了進一步證實循環機械拉伸對ITGA2 / PI3K / AKT信號通路的功能影響，使用siRNAs敲低NP細胞中該通路中關鍵分子的蛋白質表達，即ITGA2和AKT。結果顯示，ITGA2和AKT蛋白顯著降低（圖3 b），表明ITGA2/PI3K/AKT信號通路受到抑制。當NP細胞加載循環機械拉伸時，ITGA2和AKT表達沒有明顯變化。然后實驗確定了NP細胞增殖。該通路的抑制顯著抑制了NP細胞的增殖（圖3 c），而循環機械拉伸對轉染siRNA-ITGA2/AKT的NP細胞增殖沒有顯著影響。這些結果表明，ITGA2/PI3K/AKT信號通路在循環機械拉伸對NP細胞增殖的影響中起關鍵作用。

有趣的是，發現循環機械拉伸提高了NP細胞中COL2A1蛋白的表達（圖3 a）。在敲低ITGA2/PI1K/AKT信號通路后，COL2A1蛋白表達顯著降低（圖3 b）。COL2A1是NP組織中ECM的主要成分，被認為是IVD變性的關鍵分子。這些結果表明，循環機械拉伸可以通過ITGA2/PI3K/AKT信號通路調節COL2A1的表達，并改善NP細胞的退變。

圖3   PI3K-AKT通路參與循環機械拉伸介導的對NP細胞的影響。

（a）循環機械拉伸促進了NP細胞中的PI3K-AKT通路。ITGA2、p-AKT、AKT和COL2A1的蛋白表達在拉伸應力組中上調。（b）抑制PI3K-AKT通路。蛋白質印跡分析顯示轉染siRNA-ITGA2 / AKT的NP細胞中ITGA2和AKT蛋白表達的下調。COL2A1蛋白表達顯著降低。循環機械拉伸對轉染siRNA-ITGA2/AKT的NP細胞中ITGA2、AKT和COL1A2的表達沒有顯著影響。（c）PI3K-AKT通路的下調顯著抑制了NP細胞的增殖。當PI3K-AKT通路受到抑制時，循環機械拉伸對NP細胞的增殖沒有顯著影響。

綜上所述，循環機械拉伸促進了NP細胞增殖和細胞周期從S期向G2期的轉變，并抑制了NP細胞的凋亡。微陣列分析結果顯示，689個基因具有顯著的差異表達。對調控信號通路中所有DEGs的富集分析發現了PI3K/AKT通路。結果進一步表明，循環機械拉伸通過調節ITGA2/PI3K/AKT信號通路促進細胞增殖和COL2A1表達，改善NP細胞的退變。這些研究結果可能提供潛在的靶點和通過逆轉退行性變化來治療IVDD疾病的可能性。

參考文獻：Wang D, Chen Y, Cao S, Ren P, Shi H, Li H, Xie L, Huang W, Shi B, Han J. Cyclic Mechanical Stretch Ameliorates the Degeneration of Nucleus Pulposus Cells through Promoting the ITGA2/PI3K/AKT Signaling Pathway. Oxid Med Cell Longev. 2021 Mar 16;2021:6699326. doi: 10.1155/2021/6699326. PMID: 33815660; PMCID: PMC7990548.

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