正畸治療中其可將壓力轉化為生物信號由胞外傳遞到胞內，進而誘導一系列相關信號傳遞反應，影響牙齦組織改建過程。人牙齦成纖維細胞（HGFs）是牙齦組織的主體細胞，它們可以接收和傳輸信號。在過去的幾十年中，盡管許多小組廣泛研究了牙槽骨和牙周膜在壓力下的重建，但牙齦重建的機制在很大程度上仍未得到探索。

在廣西醫科大學口腔醫學院團隊之前的研究中，發現靜壓力可以促進轉化生長因子（TGF）-β1的表達和HGFs的增殖。TGF-β是調控細胞增殖和凋亡的重要生長因子，然而涉及TGF-β調控HGFs增殖和凋亡的因子和信號通路仍然未知。Smad4是TGF-β信號通路的關鍵下游因子，起著至關重要的調節作用。在經典的TGF-β通路中，激活的Smad2/3和Smad4形成SMAD復合物，其易位到細胞核。Smad4被認為是與細胞凋亡密切相關的腫瘤抑制基因。已經發現Smad4通過調控細胞凋亡相關蛋白來影響細胞凋亡，例如，Smad4在結腸癌中的低表達可以通過促進Bcl-2和Bcl-w表達來抑制細胞凋亡，并降低caspase-3 和caspase-9 的表達。因此，該團隊假設Smad4可能在靜壓力作用下HGFs的增殖和凋亡中起關鍵作用。

可生物降解聚乳酸-乙醇酸聚合物（PLGA）已成為應用zui廣泛的生物支架材料之一。與其他支架材料相比，PLGA具有良好的生物學特性。與二維培養相比，三維（3D）培養可以更有效地模擬人體內部的自然環境，并提高實驗結果的準確性和可靠性。因此，該團隊建立了3D HGF-PLGA培養模型，探討Smad4、caspase-3 和Bcl-2在調控HGFs增殖和凋亡通路中的作用，旨在進一步了解正畸牙齦重建的分子機制。

靜壓力誘導HGFs的增殖

首先，實驗建立了三維PLGA-HGFs培養模型，如圖1。與對照組（0 h）相比，HGFs在25g/cm2 的靜壓力下作用12、24和48 h后增殖能力顯著提高，24 h達到峰值。隨后當加力至72 h后，HGFs的增殖受到抑制，細胞活力降低。

圖1   靜壓力負荷示意圖。

靜壓力降低了 HGFs 中 Smad4 的表達

Smad4的基因和蛋白表達在靜壓力作用下顯著下降，在24 h達到zui低水平。隨后，表達水平在48 h和72 h 時升高（圖2）。

圖2   靜壓力以時間依賴性的方式調節HGFs中的Smad4表達。

靜壓力作用下Smad4在HGFs中的mRNA（A）和（B）蛋白表達。

HGFs 中 caspase-3 和Bcl-2的表達隨靜壓力的變化而改變

caspase-3 的基因和蛋白表達顯著下降，在24 h達到zui低水平。隨后，其表達在48 h和72 h 增加。然而，Bcl-2的基因和蛋白表達量較對照組顯著增加，24 h達到峰值。隨后，表達水平逐漸降低（圖3）。

圖3   靜壓力以時間依賴性方式調節HGFs中細胞凋亡相關蛋白的表達。

在壓力下半胱天冬酶-3和Bcl-2的mRNA（A）和（B）蛋白表達。

Smad4 mRNA和蛋白質水平評估

在用Lv-Smad4轉染HGFs后72 h，增強型綠色熒光蛋白的表達效率為~90%。此外，基因和蛋白質表達分析顯示，與Lv-對照組和空白對照組相比，Smad4 mRNA表達量在Lv-Smad4組顯著上調（圖4 ）。與空白對照組相比，Lv-對照組的Smad4 蛋白表達量顯著下降，表明慢病毒系統有效遞送外源性Smad4基因。

圖4   用Lv-Smad4轉染后人牙齦成纖維細胞中的Smad4基因和蛋白質表達。

用Lv-Smad4、Lv-對照或空白對照轉染后Smad4 mRNA（A）和蛋白（B）的相對表達。

Smad4過表達抑制靜壓力對HGFs增殖的影響

CCK-8測定表明，HGFs的吸光度值隨培養時間的增加而增加（圖5）。前2天，Lv-Smad4組、Lv-對照組和空白對照組光密度（OD）值差異無統計學意義。然而，從第3天開始，Lv-Smad4組的OD值與Lv-對照組和空白對照組相比下降。此外，從第5天開始，3組之間差異均有統計學意義，空白對照組OD值zui高，Lv-Smad4組OD值zui低。此外，CCK-8結果顯示Smad4參與了靜壓力誘導的HGFs增殖，如圖5 B。與施加力前相比，Lv-Smad4組在靜壓力24 h后HGFs增殖沒有顯著增加（圖5 B）。相反，在Lv-對照組和Lv-Smad4組中，連續靜壓力刺激24 h顯著增加了HGFs增殖（圖5 B）。

圖5   Smad4過表達抑制靜壓力對HGFs增殖的影響。 

（A）慢病毒轉染后HGFs的增殖。（B）在壓力作用下HGFs 的增殖。

Smad4過表達逆轉了caspase-3 和Bcl-2在HGFs中的表達

為了確定Smad4在靜壓力下是否介導caspase-3 和Bcl-2的表達，實驗在在HGFs中過表達Smad4。雖然連續靜壓力刺激24 h可顯著降低Lv-Smad4組Smad4的表達，但Smad4表達量較Lv-對照組和空白對照組上調。此外，與對照組相比，在有或沒有靜壓力刺激的情況下，Lv-Smad4組Bcl-2和caspase-3 的表達水平分別下調和上調（圖6）。這些發現表明，Smad4是HGFs中重要的細胞凋亡相關因子，靜壓力通過下調Smad4的表達抑制HGFs細胞凋亡并促進增殖。

圖6   Smad4過表達對細胞凋亡相關蛋白表達的影響。

（A）Smad4、（B）半胱天冬酶-3和（C）Bcl-2基因和蛋白質在靜壓力下的表達。

綜上所述，Smad4在靜壓力作用下通過調節caspase-3 和Bcl-2促進HGFs增殖。因此，Smad4可能是正畸治療后預防牙齦增生的重要靶點。然而，該研究存在某些局限性。例如，僅使用CCK-8測定分析增殖和凋亡，應使用其他方法，例如流式細胞術。此外，關于Smad4的討論僅限于增強Smad4的表達，隨后的研究應該通過沉默Smad4來進一步驗證這些發現。

參考文獻：Zhao S, Nan L, Wang Y, Wei L, Mo S. Effects of Smad4 on the expression of caspase?3 and Bcl?2 in human gingival fibroblasts cultured on 3D PLGA scaffolds induced by compressive force. Int J Mol Med. 2021 Mar;47(3):04858. doi: 10.3892/ijmm.2021.4858. Epub 2021 Jan 26. PMID: 33495811; PMCID: PMC7846422.

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