胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）以對傳統(tǒng)治療的耐藥性而聞名，復(fù)發(fā)率高，5年生存率低。最近，一些報告顯示，PDAC更容易受到鐵死亡誘導(dǎo)劑的影響。鐵死亡是一種新型的鐵依賴性程序性細(xì)胞死亡，其特征是膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的積累和質(zhì)膜多不飽和脂肪酸的消耗，區(qū)別于細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死、細(xì)胞自噬。癌細(xì)胞具有高表達(dá)的FSP1、SLC7A11 和GPX4 來抵抗鐵死亡。作為腫瘤組織中zui豐富的基質(zhì)細(xì)胞，癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）在鐵死亡過程中的作用仍未被發(fā)現(xiàn)。

胰腺星狀細(xì)胞（PSCs）是胰腺癌CAFs的主要來源，與PDAC的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。在小鼠PDAC的原位異種移植模型中，共植入癌細(xì)胞和CAFs導(dǎo)致治療耐藥性和氧化還原狀態(tài)增加。此外，PSCs可以通過直接和間接的方式與癌細(xì)胞相互作用，以支持腫瘤非必需氨基酸和脂質(zhì)生物合成代謝，從而進(jìn)一步促進(jìn)癌細(xì)胞存活和細(xì)胞死亡抵抗。由于氧化還原狀態(tài)和脂質(zhì)生物合成在癌細(xì)胞鐵死亡中的關(guān)鍵作用，因此可推測PSCs可能在旁分泌途徑中發(fā)揮作用，以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞鐵死亡抵抗。

為了驗證這一假設(shè)，江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院影像科、醫(yī)學(xué)檢驗科以及江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究團(tuán)隊使用共培養(yǎng)模型，并揭示了活化的 PSCs 促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞鐵死亡抵抗的機制。活化的 PSCs 分泌 HGF，導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞中肝細(xì)胞生長因子受體（c-MET）表達(dá)增加并增強抗氧化能力。因此，有可能將抗纖維化藥物與鐵死亡誘導(dǎo)劑聯(lián)合使用，作為一種新的潛在臨床治療策略，以促進(jìn)難治性的胰腺癌鐵死亡。

活化的 PSCs 促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞鐵死亡抵抗作用

為了研究 PSCs 在胰腺癌細(xì)胞鐵死亡敏感性中的作用，將分離的原代 PSCs 與 Panc02 細(xì)胞共培養(yǎng)（圖1）。與對照PSCs相比，共培養(yǎng)的PSCs（Co-PSCs）顯示出多邊形和扁平的形態(tài)，并且代表脂滴的紅色細(xì)胞群數(shù)量減少。研究表明，α-SMA表達(dá)上升被認(rèn)為是PSCs活化的顯著特征。蛋白質(zhì)印跡、qRT-PCR 和免疫熒光顯示，α-SMA 在 Co-PSCs 中的表達(dá)水平顯著上調(diào)。這些結(jié)果表明，分離的原代 PSCs在胰腺癌細(xì)胞存在下被激活。

接下來，評估了有或沒有活化的PSCs的胰腺癌細(xì)胞的鐵死亡敏感性。Panc02與或不與活化的PSCs共培養(yǎng)，然后用Erastin（鐵死亡誘導(dǎo)劑）或 RSL3（GPX4 的抑制劑）處理。與對照組相比，Erastin和RSL3可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，可通過鐵死亡挽救劑 Fer-1 挽救細(xì)胞死亡，提示Panc02細(xì)胞發(fā)生了鐵死亡。此外，在活化的 PSCs 存在下，Erastin 或 RSL3 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡被逆轉(zhuǎn)。

在活化的PSCs存在下，Panc02中GPX4的mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)顯著增加，SLC7A11僅在mRNA水平升高，而FTH1和NCOA4（鐵代謝指標(biāo)）的mRNA水平?jīng)]有顯著改變。此外，還評估了鐵2+ 水平，結(jié)果顯示Erastin和RSL3升高了Panc02細(xì)胞鐵2+ 水平。相比之下，活化的 PSCs 對鐵2+ 沒有顯著影響。SLC7A11作為Xc-系統(tǒng)的主要亞基，能夠?qū)㈦装彼徂D(zhuǎn)運進(jìn)胞內(nèi)，合成GSH，穩(wěn)定GPX4的表達(dá)與活性，抑制細(xì)胞脂質(zhì)過氧化。因此實驗研究了活化的PSCs是否影響Panc02細(xì)胞中的GSH濃度。在Erastin和RSL3處理后，Panc02細(xì)胞中的GSH水平受到抑制，MDA水平（脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物）升高，通過與活化的PSCs共培養(yǎng)來抵消。同時，與活化的PSCs共培養(yǎng)可有效抑制鐵死亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的脂質(zhì)ROS積累。以上的結(jié)果都表明，活化的PSCs介導(dǎo)了胰腺癌細(xì)胞的鐵死亡抵抗。 

圖1   建立Panc02細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的模型。

活化的 PSCs 分泌的 HGF 介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞中的鐵死亡抵抗

活化的 PSCs 根據(jù)分泌的各種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)。接下來，實驗評估了這些細(xì)胞因子在Co-PSCs中mRNA水平的表達(dá)。CCL7、HGF、CCL2、SDF-1α、IGF-1 和 CCL5 在 Co-PSCs 中上調(diào)，其中 HGF 上調(diào)zui顯著。ELISA 測定進(jìn)一步證實，共培養(yǎng)的 PSCs 分泌的 HGF 顯著增加。

為了進(jìn)一步驗證活化的PSC衍生的HGF在Panc02鐵死亡中的作用，用HGF（5 ng/ml）培養(yǎng)Panc02細(xì)胞，然后用不同濃度的鐵死亡誘導(dǎo)劑處理。與正常對照組相比，用HGF處理的Panc02癌細(xì)胞在鐵死亡誘導(dǎo)劑存在下增強了細(xì)胞活力（圖2 c）。然后，用以下條件處理Panc02：（1）DMSO，（2）HGF（5 ng/ml），（3）Erastin（2 μM）或RSL3（0.1 μM）和（4）HGF（5 ng/ml）+ Erastin （2 μM）/ RSL3（0.1 μM）。與DMSO組相比，HGF處理增加了SLC7A11和GPX4 的mRNA的表達(dá)水平以及GPX4的蛋白質(zhì)水平表達(dá)（圖2 d、e）。HGF逆轉(zhuǎn)了由Erastin或RSL3誘導(dǎo)的GSH降低和MDA積累（圖2 f、g）。此外，與Erastin/RSL組相比，HGF+Erastin/RSL3組在Panc02細(xì)胞中抑制脂質(zhì)ROS水平（圖2 h）。這些數(shù)據(jù)表明，活化的PSCs分泌的HGF促進(jìn)了胰腺癌細(xì)胞的鐵死亡抵抗。

圖2   活化的 PSCs 分泌的 HGF 介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞中的鐵死亡抵抗。

在存在活化的 PSCs 的情況下抑制 c-MET 致敏胰腺癌細(xì)胞對鐵死亡的抑制

c-間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（c-MET）是一種HGF受體，已被證明在各種癌癥的治療耐藥性中起著決定性的作用。為了進(jìn)一步確認(rèn)HGF/c-MET軸在Panc02鐵死亡抗性中的作用，實驗在共培養(yǎng)系統(tǒng)中添加了c-MET抑制劑c-MET-IN-1。c-MET-IN-1顯著增強了胰腺癌細(xì)胞對鐵死亡的敏感性，降低了細(xì)胞存活率。c-MET-IN-1聯(lián)合鐵死亡誘導(dǎo)劑（Erastin和RSL3）降低了GPX4 蛋白表達(dá)水平。c-MET-IN-1還顯著促進(jìn)了鐵死亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的GSH降低以及MDA和脂質(zhì)ROS的積累。

除了在藥理學(xué)水平上抑制c-MET外，實驗還選擇兩種穩(wěn)定的c-MET敲低胰腺癌細(xì)胞克隆（c-MET shRNA2和shRNA3），且具有更高的沉默效率（圖3 g）。Erastin 和 RSL3 在共培養(yǎng)條件下或在存在 HGF下誘導(dǎo)更多c-MET敲低的胰腺癌細(xì)胞死亡（圖3 h）。敲低c-MET在Panc02細(xì)胞的mRNA和蛋白質(zhì)水平上下調(diào)了GPX7，而不是SLC7A11（圖3 i-j）。此外，在鐵死亡誘導(dǎo)劑存在下，c-MET的敲低降低了活化的PSCs共培養(yǎng)和HGF處理的胰腺癌細(xì)胞中的GSH含量并增加了脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA的生成和脂質(zhì)ROS的產(chǎn)生（圖3 k）。

圖3   抑制c-MET使胰腺癌細(xì)胞在活化的PSCs存在下對鐵死亡敏感。

活化的 PSCs 促進(jìn)體內(nèi)胰腺癌的鐵死亡抵抗力

為了進(jìn)一步證實體外觀察結(jié)果，實驗接下來研究了活化的PSCs和HGF是否在促進(jìn)體內(nèi)胰腺癌的鐵死亡抵抗中起作用。然后在C57BL/6小鼠皮下注射有或沒有活化的PSCs的Panc02。將C57BL/6小鼠隨機分為以下幾組：（1）DMSO（對照組），（2）PSCs，（3）HGF，（4）PE，（5）PSCs+PE和（6）HGF+PE，并每兩天用相應(yīng)的藥物治療一次。哌-嗪埃拉斯汀（PE）有效抑制C57BL/6小鼠皮下腫瘤的生長。與對照組相比，PE組體重較低，GSH水平降低，MDA水平升高。與對照組相比，PSC+PE和HGF+PE組的腫瘤體積以及GSH和MDA水平均無顯著變化。與PE組相比，PSC+PE和HGF+PE組表現(xiàn)出GSH水平升高和MDA水平降低。同時，PSC組和HGF組也顯示出相對于對照組更高的GPX4表達(dá)水平。與體外結(jié)果一致，PSCs與HGF在體內(nèi)也參與了胰腺癌的鐵死亡抵抗。

免疫組織化學(xué)還進(jìn)一步證明了c-MET在PSC和HGF組腫瘤組織中的高表達(dá)。GEPIA數(shù)據(jù)庫顯示，c-MET在人類胰腺癌中的表達(dá)水平高于正常胰腺組織。此外，c-MET表達(dá)水平與總生存率呈負(fù)相關(guān)。GEPIA和TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示，，c-MET 與 NRF2、SLC7A11等抗鐵死亡指標(biāo)呈顯著正相關(guān)關(guān)系，表明c-MET參與了鐵死亡抵抗的進(jìn)程。

圖4   活化的 PSCs 旁分泌 HGF 介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞鐵死亡抵抗的機制示意圖。

活化的PSCs可以分泌HGF，增強胰腺癌細(xì)胞的抗氧化能力，從而抵抗鐵死亡。在這方面，HGF/c-MET軸在胰腺癌細(xì)胞防御鐵死亡方面起著至關(guān)重要的作用。

綜上所述，該研究表明胰腺癌細(xì)胞可以激活胰腺星狀細(xì)胞，促進(jìn)其HGF的分泌，增強胰腺癌細(xì)胞的抗氧化能力，介導(dǎo)胰腺癌的鐵死亡抵抗力。它意味著一種潛在的治療胰腺癌的選擇，著眼于胰腺癌纖維化的微環(huán)境。然而，這一假設(shè)需要通過進(jìn)一步的研究來證實，以更好地治療胰腺癌。

參考文獻(xiàn)：Wu Q, Song L, Guo Y, Liu S, Wang W, Liu H, Gong A, Liao X, Zhu H, Wang D. Activated Stellate Cell Paracrine HGF Exacerbated Pancreatic Cancer Cell Ferroptosis Resistance. Oxid Med Cell Longev. 2022 Jun 1;2022:2985249. doi: 10.1155/2022/2985249. PMID: 35693705; PMCID: PMC9177329.

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