動脈粥樣硬化是一種動脈慢性炎癥性疾病，其特征是脂質成分和巨噬細胞堆積形成斑塊，其中這些細胞在炎癥反應中起著至關重要的作用。沿血流循環的單核細胞被募集到動脈壁，其運動受趨化因子c-c基序趨化因子配體2（CCL2）的調控，單核細胞暴露于剪切應力有助于它們更容易穿透內皮。遷移后，單核細胞分化成活化的巨噬細胞。巨噬細胞的激活在傷口愈合的組織修復和再生中起著重要作用，而活化至M1表型的巨噬細胞會分泌大量促炎細胞因子，如CCL2、IL-1β和TNF-α。因此，巨噬細胞的激活促進周圍微環境調控的促炎或抗炎作用。巨噬細胞通常位于斑塊破裂部位，可能受到機械刺激。然而，巨噬細胞在承受機械應力時的功能是未知的。

血流動力學剪切應力是一種機械因素，被認為是動脈粥樣硬化的主要因素。為了更好地了解生物力學刺激對炎癥的影響，韓國國立釜山大學醫學院藥學系、韓國生命工學研究院、嶺南大學藥學系聯合團隊的一項研究將人THP-1單核細胞/巨噬細胞暴露于剪切應力下，并檢測炎癥分子的表達。這項研究中報告了新的結果，表明生物力學刺激是激活單核細胞/巨噬細胞為促炎表型的因素之一，還確定了被認為與剪切應力誘導的炎癥反應相關的膜蛋白。此外，使用人和小鼠動脈粥樣硬化斑塊標本研究了已識別的一種蛋白的表達，以驗證結果的體內相關性。

剪切應力誘導促炎 M1 標志物的產生

為了研究剪切應力是否影響單核細胞/巨噬細胞的表型，實驗利用THP-1細胞確定了剪切應力對M1/ M2標志物的時間過程影響。RT-PCR顯示CCL2、IL-1β和TNF-α的轉錄水平在暴露于剪切應力（SS，12 dynes/cm2）12小時后開始增強，并在24小時變得明顯（圖1 A）。相比之下，在暴露于剪切應力24小時后，M2標記物CD163和LXRα的轉錄水平降低。這些結果表明，剪切應力誘導促炎M1標志物的轉錄。

然后通過ELISA測定了CCL2，TNF-α和IL-1β的分泌水平（圖1 B）。剪切應力暴露12和24小時后，CCL2分泌增加。THP-1細胞分泌少量或幾乎檢測不到的TNF-α和IL-1β，但剪切應力應用12和24小時后，TNF-α 和 IL-1β分泌增加。這些結果表明，剪切應力增強了促炎分子的分泌。

這些數據表明，剪切應力在轉錄和蛋白質水平上增加了多個M1標記分子的單核細胞/巨噬細胞表達，極化為促炎表型。

圖1   剪切應力對M1極化標記物的影響。

剪切應力對CCL2、TNF-α和IL-1β的表達是可逆的

接下來研究了M1標志物的表達是否受到剪切應力消失的影響（圖1 C、D）。剪切應力處理24小時后，CCL2，TNF-α和IL-1β的轉錄水平增加，但在無剪切應力的正常培養條件下再培養24 小時時，轉錄水平顯著降低（圖1 C）。實驗還測量了這些標志物的分泌。將剪切應力刺激的細胞分為兩組：在沒有剪切應力暴露的情況下再培養24小時，沒有（ST）和有改變培養基（mc ST）（圖1 D）。CCL2和TNF-α的分泌在剪切應力下增加，當細胞恢復到正常培養條件而沒有改變培養基時繼續分泌。CCL2分泌進一步增強。然而，當剪切應力細胞在正常培養條件下且改變培養基時，CCL2、TNF-α和IL-1β的分泌顯著減少或降低到基礎水平。這些結果表明，由剪切應力誘導的炎癥分子的表達在剪切應力刺激細胞中是可逆的。

ERK 和 Src 通路抑制劑可抑制剪切應力誘導的 M1 標志物表達

由于SRC和ERK信號參與巨噬細胞極化為促炎表型，實驗使用MEK抑制劑U0126評估了它們在剪切應力誘導的M1標志物表達中的作用，該抑制劑可激活ERK1/2和SRC激酶抑制劑PP2（圖1 E）。暴露于剪切應力的THP-1細胞中CCL2的轉錄水平增加。然而，在U0126和PP2存在的情況下，這種增加開始降低。IL-1β轉錄水平也以類似于CCL2的模式下降，而TNF-α的轉錄水平沒有通過兩種抑制劑的處理而改變。在剪切應力下，這些結果表明，ERK和SRC信號通路參與巨噬細胞CCL2和IL-1β的表達，而不是TNF-α的表達。

剪切應力上調表層蛋白（包括 HSPs）的表達

接下來實驗研究了剪切應力是否改變了細胞表層的蛋白質水平。從THP-1細胞中分離細胞表層蛋白（圖2 A），然后研究了剪切應力是否會影響熱休克蛋白105、熱休克蛋白90、熱休克蛋白70（ HSP105，HSP90，HSP70）和人腺苷酸環化酶關聯蛋白1（ CAP1）的轉錄和蛋白質水平。HSP105和CAP1的轉錄水平沒有變化，而HSP90和HSP70的轉錄水平增加（圖2 B）。然后分析蛋白質表達（圖2 C），HSP105，HSP90和HSP70的細胞水平與對照組（0 h SS）相比增加。然后測定它們在膜上的水平（圖2 D），剪切應力24h后，THP-1細胞表層蛋白水平上調。在上述蛋白質中，CAP1的表達增加zui低。

流式細胞術測定的暴露于剪切應力后，HSP105、HSP90 和 HSP70 的水平在 THP-1 細胞表面上調（圖2 E）。當用共聚焦顯微鏡觀察免疫染色的THP-1細胞時，觀察到該蛋白質的表面表達增加（圖2 F）。這些數據表明，剪切應力上調了單核細胞中HSP105，HSP90和HSP70的細胞內和表面水平。

圖2   剪切應力對表層蛋白的影響。

抑制HSPs 可抑制剪切應力誘導的炎癥標志物表達

實驗研究了HSPs是否參與剪切應力誘導的炎癥分子的表達。首先，使用兩種抑制劑17-DMAG和STA-9090檢查HSP90的參與。CCL2、TNF-α和IL-1β基因的轉錄水平在暴露于剪切應力后增加，并且在17-DMAG或STA-9090存在下顯著被抑制。在17-DMAG或STA-9090存在下，剪切應力增強的CCL2，TNF-α和IL-1β的分泌被阻斷。這些結果表明，HSP90的藥理學抑制導致炎癥反應減少。

此外還利用VER155008和knk437研究了HSP70和HSP105是否參與了促炎表型的極化。VER155008是HSP70家族的有效抑制劑，而knk437抑制多種HSPs，包括HSP105和HSP70。在VER155008和knk437存在下，剪切應力誘導的CCL2，TNF-α和IL-1β基因的轉錄水平受損，CCL2，TNF-α和IL-1β的分泌也受到顯著抑制。其中，knk437有效抑制炎癥分子的表達。這些結果表明，HSP105和HSP70抑制劑降低了炎癥分子的表達。

實驗觀察到剪切應力后CCL2分泌增加。于是研究了分泌的CCL2是否具有功能，因為CCL2是單核細胞的有效趨化因子。剪切應力24小時后的THP-1細胞上清液中含有高水平的CCL2，增加了單核細胞的遷移。在剪切應力暴露后獲得的上清液中，細胞遷移增強，而當細胞暴露于在HSP90、HSP70和HSP105抑制劑存在下的上清液時，細胞遷移降低，與CCL2分泌的結果一致。這些結果表明，HSP90、HSP70和HSP105影響剪切應力誘導的免疫細胞遷移。總的來說，這些數據表明，剪切應力后HSPs上調參與剪切應力誘導的炎癥反應。

CD68 和 HSP90 在 ApoE-缺陷小鼠和人股動脈的動脈粥樣硬化病變中共存與共定位

最后實驗研究了HSP90在發生血流紊亂的動脈粥樣硬化病變中的巨噬細胞表達。ApoE-缺陷小鼠出現動脈粥樣硬化病變（圖3 A）。HSP90和CD68（泛巨噬細胞標志物）免疫反應性在ApoE-缺陷小鼠的動脈粥樣硬化病變中檢測到，但在野生型小鼠的動脈粥樣硬化病變中未檢測到（圖3 A）。

為了研究HSP90和CD68的共定位，使用了人類標本。在股動脈動脈粥樣硬化斑塊的肩部區域檢測到CD68和HSP90的免疫反應性（圖3 B）。當兩個圖像合并時，觀察到兩個分子的廣泛共定位。一些CD68/HSP90陽性細胞位于血管內壁的管腔側或下方，細胞容易受到剪切應力（a）。然而，在沒有剪切應力的巨噬細胞缺失的區域沒有檢測到HSP90表達（b）。這些數據表明，體內巨噬細胞HSP90的表達在剪切應力條件下增加。

圖3   免疫組織化學（IHC）分析小鼠和人源性動脈粥樣硬化病變中CD68和HSP90的表達。

圖4   暴露于血流的巨噬細胞介導的炎癥示意圖。駐留在受損動脈剝落區域的巨噬細胞受到剪切應力并分泌炎性細胞因子，包括CCL2，TNF-α和IL-1β。分泌的CCL2促進單核細胞/巨噬細胞的募集到該區域，從而增加免疫細胞的數量。受剪切應力影響的巨噬細胞也會增加HSPs的表層表達，例如HSP105，HSP90和HSP70，這是產生炎性細胞因子和趨化因子所必需的。剪切應力通過表層蛋白的上調參與巨噬細胞介導的炎癥。

總之，這項研究的結果表明，剪切應力激活單核細胞/巨噬細胞，使它們上調炎癥分子的表達和HSPs的細胞表層水平，如HSP70，HSP90和HSP105，這可能是主動脈血管內皮剝脫后血管炎癥的治療靶點。未來需要進一步研究HSPs在體內血管重塑中的作用，并了解機械刺激下炎癥分子和HSPs表達的機制。

參考文獻：Son H, Choi HS, Baek SE, Kim YH, Hur J, Han JH, Moon JH, Lee GS, Park SG, Woo CH, Eo SK, Yoon S, Kim BS, Lee D, Kim K. Shear stress induces monocyte/macrophage-mediated inflammation by upregulating cell-surface expression of heat shock proteins. Biomed Pharmacother. 2023 May;161:114566. doi: 10.1016/j.biopha.2023.114566. Epub 2023 Mar 22. PMID: 36963359.