局灶性粘附（FAs）是復雜的多蛋白結構，通過將細胞骨架連接到細胞外基質（ECM）來介導細胞粘附，并通過翻譯肌動蛋白應激纖維上的外力來促進細胞遷移。根據其數量、大小和組成，結合肌球蛋白-II的收縮力，FAs 作為機械傳感器將機械力從細胞骨架傳遞和傳導到ECM。細胞將來自周圍環境的機械線索轉化為細胞內生化信號的能力在機械活性組織（如心肌）中至關重要，其中協調的肌肉收縮取決于適當的機械性能和電耦合。在心臟組織內，機械力通過稱為肋節的專用FA復合物傳遞到肌動球蛋白。肋節能將肌細胞膜，與肌原纖維、細胞外基質、還有肌纖維上特點的點位（肌節）連接起來，加強肌細胞膜的穩定性和強度，在一定程度上保護它們免收外力損傷。

黏著斑蛋白（Vinculin）是一種膜細胞骨架蛋白兼粘著斑組成蛋白，參與整合素粘附分子連接到肌動蛋白細胞骨架，在調節FA形成和周轉中起關鍵作用，將肌節錨定在細胞膜上。事實上，在擴展形式（活性狀態）下，黏著斑蛋白與踝蛋白（Talin）相互作用，直接影響整合素聚集，從而影響FA成熟。此外，在FAs中限制黏著斑蛋白決定了樁蛋白（Paxillin）的募集，而樁蛋白反過來又促進了參與FA形成的其他蛋白質的募集和相互作用。

研究證據都證實了黏著斑蛋白在肌動蛋白細胞骨架動力學中的重要作用，不僅在維持心臟組織的適當功能方面，而且在心臟形態發生方面。據文獻報道，心肌中黏著斑蛋白的缺失導致粘附連接、間隙連接和結締組織的不穩定，導致機械和電耦合不足。

整合素是介導細胞與細胞外基質黏附作用的主要因子，可以和其他因子產生協同作用，如局灶性黏附激酶（FAK）。此外，FAs也是張力依賴性細胞變化的主要調節因子。在心臟形態發生過程中，機械力是調節心臟分化所必需的。

為了提供更多關于FAs在細胞分化和細胞機械穩定性中的調節方面的實驗證據，意大利東方皮埃蒙特大學健康科學學系研究團隊的一項實驗曾集中探討了黏著斑蛋白和FAK在H9c2心肌細胞中的作用。研究內容發表在 International Journal of Molecular Sciences  期刊題為“Cardiac Differentiation Promotes Focal Adhesions Assembly through Vinculin Recruitment"。

首先，通過GATA-4、Mef2c、Nkx2.5等心肌細胞的標志物的基因表達檢測H9c2細胞的成肌分化。結果顯示，在分化開始時兩個早期心臟標志物GATA-4和Mef2c在4 天后表達上調。相反，心臟轉錄因子Nkx2.5在分化第7天才顯著表達。為了進一步證實心肌細胞的分化，檢測了心肌肌鈣蛋白T（cTn T ，一種參與心肌細胞功能成熟的蛋白）的表達，結果顯示，其在第7天顯著上調。獲得的結果證實了H9c2心肌細胞的正常分化。

鑒于FAs在心肌形成過程中的作用，接下來研究了部分黏著蛋白（adhesion proteins）的存在、定位和激活。

FAK是整合素信號途徑中的重要信號轉導分子，在參與心肌形成的多種信號通路的匯合中起著節點的作用。FAK被激活時表現為磷酸化，其中，Tyr397是FAK的一個關鍵位點，該磷酸化可招募Src家族激酶，進而促進參與心臟分化的其他信號通路。蛋白質印跡評估了FAK的活化，顯示分化細胞在第4天和第7天的pFAK顯著增加。抗FAK Ab染色結果顯示，肌動蛋白相關的FAK信號在分化細胞中變得更加明顯。

此外，還通過檢測FAs的主要成分之一黏著斑蛋白來研究FA的形成和H9c2分化。通過蛋白質印跡分析總蛋白和亞細胞部分黏著蛋白表達和膜募集，結果顯示，7天后分化細胞中的黏著斑蛋白表達和募集顯著增強。

分化7天后，觀察細胞的形態變化（長度）和每個細胞的FAs數量（圖1）。細胞呈典型的心肌細胞樣貼壁細胞形態，具有局灶黏附紡錘狀特征。此外，隨著時間的推移和分化，FAs中黏著斑蛋白的信號更加明顯，證實了上述結果。值得注意的是，形態測量分析顯示分化7天時FAs的長度顯著增加，而且每個細胞檢測到的FAs數量更高。

圖1      通過黏著斑蛋白（紅色）染色獲得的H9c2細胞形態。圖像表示4（A）和7（C）天的對照細胞以及4（B）和7（D）天的分化細胞。白色箭頭表示粘連中的黏著斑蛋白。

最后，為了強調FAs在心臟表型中的重要性，H9c2心肌細胞在生長和分化培養基中承受5%伸長率和1 Hz頻率的循環機械應力4和7天。結果顯示，機械拉伸后，細胞定向和排列平行于張力方向（圖2）。這些數據表明，機械拉伸可翻譯心肌細胞中的定向信號。

此外，評估了H9c2分化過程中FAs的表達，結果顯示，分化細胞和機械應力刺激的細胞的細胞膜中有很強的黏著斑蛋白信號，而在對照細胞中，黏著斑蛋白的存在主要與細胞質有關。有趣的是，形態計量學分析顯示，代表分化細胞在第7天形成的FAs長度的高斯曲線發生了顯著變化（圖3）。這些數據證實了FAs的形態重組與機械應力之間的比例相關性。

圖2   H9c2心肌細胞在靜態（A、B）和動態（5% 底物變形，1 Hz頻率）條件下（C、D）維持7天的形態特征。黑色箭頭表示拉伸方向。

圖3      在靜態和動態（5% 基質變形，1 Hz頻率）條件下，在生長和分化培養基中生長7天的H9c2粘連的形態分析（長度）。

圖4    圖形概要

通過FAs激活的機械轉導通路高度參與心肌細胞分化，從而證實了它們在細胞骨架重排（cytoskeleton rearrangement）和心肌肌絲成熟（cardiac myofilament maturation）中的作用。

綜上所述，這些發現確定了FAs對細胞骨架（F-肌動蛋白）重排的重要性，從而對心肌細胞分化產生了強烈影響。此外，FAs在傳遞心臟功能所需的機械線索方面發揮作用，概述了肋狀體（cotamerares）和FAs在維持心臟收縮力方面的積極影響。FA組裝缺陷與多種心臟疾病有關，如心肌病。這些發現為心血管組織工程和再生提供了有價值的見解，強調了FAs在心肌細胞分化過程中的關鍵作用，從而表明它們作為改善心肌病結局的再生靶點的潛在應用。然而，需要進行進一步的研究，以充分了解機械應力、FA 變化和心臟分化之間的聯系。

參考文獻：Carton F, Casarella S, Di Francesco D, Zanella E, D'urso A, Di Nunno L, Fusaro L, Cotella D, Prat M, Follenzi A, Boccafoschi F. Cardiac Differentiation Promotes Focal Adhesions Assembly through Vinculin Recruitment. Int J Mol Sci. 2023 Jan 26;24(3):2444. doi: 10.3390/ijms24032444. PMID: 36768766; PMCID: PMC9916732.

原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36768766/

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