正畸牙齒移動（OTM）期間產(chǎn)生的機械刺激包括拉伸和壓縮應變，它們觸發(fā)牙周膜成纖維細胞（PdLFs）的力特異性機械生物學反應，為組織和骨重塑創(chuàng)造有利的微環(huán)境。拉伸力通過增加抗炎 IL-10 的分泌和刺激成骨細胞分化來促進骨形成。由于 PdL 成纖維細胞分化為成骨細胞的內在潛力，在施加拉力時檢測到堿性磷酸酶（ALP）和 runt 相關轉錄因子2（RUNX2）等成骨標志物的表達以及鈣沉積物的增加。相反，壓縮力通過 PdLFs 誘導缺氧和促炎細胞因子，包括 IL-6、IL-8、PGE2 以及 RANKL 的分泌來促進骨吸收微環(huán)境。

作為一種應激響應型多功能調節(jié)因子，最近發(fā)現(xiàn)生長分化因子15（GDF15）在 PdLFs 對壓縮力的機械反應中是重要的促炎調節(jié)劑。細胞外 GDF15 可以與細胞膜受體結合，此外，激活素受體樣激酶（ALK）家族的成員也結合 GDF15 并介導自分泌和旁分泌功能。除了其受體介導的信號轉導外，據(jù)報道，未經(jīng)處理的 GDF15 在易位到細胞核后也能調節(jié)基因表達。

考慮到 GDF15 在 PdL 成纖維細胞機械反應中的關鍵作用，長期暴露于 GDF15 可能會損害其功能，從而增加這些患者在正畸治療中的風險。GDF15 已被證明可以調節(jié)成骨細胞的分化和功能，從而可能改變細胞命運和 PdLFs 的機械反應，這之間似乎特別相關。因此，德國耶拿大學附屬醫(yī)院口腔正畸科的研究員在一項實驗中探討了長時間暴露于 GDF15 對 PdL 成纖維細胞特性和機械生物學功能的影響。研究成果發(fā)表在 International Journal of Molecular Sciences 期刊題為“GDF15 Promotes the Osteogenic Cell Fate of Periodontal Ligament Fibroblasts, thus Affecting Their Mechanobiological Response"。

首先，為了評估長時間暴露于 GDF15 對 hPdLFs 的影響，分析了兩種濃度的重組人 GDF15（rhGDF15：5 ng/mL；20 ng/mL）刺激 12、24 和 36 天后的代謝活性（圖1 d），發(fā)現(xiàn) 12 天的刺激導致代謝活性降低，這種降低隨著刺激時間的延長而持續(xù)。

隨后確定細胞密度（圖1 e、f），刺激 12 天后，細胞密度顯著降低，且隨著暴露時間的增加而變得更加明顯，但與應用的 rhGDF15 濃度無關。為了確定增殖細胞的比例，在 rhGDF15 暴露 12、24 和 36 天后對增殖標志物 Ki-67 進行免疫熒光染色（圖1 e、g）。在所有條件下，觀察到 Ki67 陽性細胞的比例降低，這可能是由于空間有限導致生長衰老或誘導的分化程序。在任何分析的時間點均未檢測到所應用的兩種 rhGDF15 濃度之間的顯著差異。

由于 GDF15 被報道會影響細胞存活，因此還使用臺盼藍染色（圖1h）TUNEL 測定法（圖1 i、j）分析了受損細胞的比例。然而，既沒有檢測到與培養(yǎng)持續(xù)時間相關的細胞存活變化，也沒有檢測到由暴露于 rhGDF15 引起的變化。

這些數(shù)據(jù)表明，GDF15 限制了 hPdLFs 的增殖能力，而不影響細胞存活。

圖1     GDF15限制hPdLFs的細胞增殖，但不影響細胞的長期存活。

由于細胞存活不受影響，hPdLFs 增殖減少可能是由細胞衰老或成骨分化增加引起的，這兩者都可能受到 GDF15 的影響。對早期衰老標志物 p21 的免疫熒光染色強度進行定量分析顯示，在兩種濃度 rhGDF15 刺激 12 天和 24 天后，其表達水平顯著升高，在刺激的最高時間點無法檢測到這種增加。這表明，rhGDF15 刺激 12 天后，細胞衰老激活增強，而長時間暴露后沒有觀察到顯著變化。

接下來，實驗旨在解決 GDF15 的成骨分化和潛在改變，這可能是除衰老外，刺激 hPdLFs 增殖能力降低的重要因素。對成骨標志基因 ALPL 和 RUNX2 進行定量表達分析，結果顯示，其在 rhGDF15 暴露 12 天和 24 天后水平升高（圖2 a、b）。作為成骨分化特征的堿性磷酸酶活性的進一步分析清楚地表明，其在 rhGDF15 暴露 36 天后水平升高（圖2 c、d）。值得注意的是，RNA 轉錄水平不一定與各自的蛋白質水平相關，翻譯后調控可能還會額外調節(jié)蛋白質活性。

考慮到 ALP 活性對礦化至關重要，研究員進一步分析了鈣沉積的形成，作為 rhGDF15 刺激 36 天時成骨細胞活性的標志物（圖2 e、f）。結果觀察到，在 rhGDF15 的長期刺激下，礦化沉積物的形成略有增加，但似乎也與濃度無關，然而，在成骨分化對照中這一增幅明顯更高。

這些數(shù)據(jù)表明，GDF15 在長期暴露后促進 hPdLFs 的成骨分化，而細胞衰老隨著刺激時間的縮短而更加突出。

圖2      長期暴露于GDF15可促進hPdLFs的成骨分化。

在后續(xù)研究中，實驗旨在確定通過 36 天的長時間 rhGDF15 暴露向成骨細胞命運的轉變在多大程度上影響了對機械刺激做出反應的 hPdLFs 的功能。為此，應用雙軸拉伸力（15.9%），抗炎標志物IL-10（圖3 a）和 IL-1RA （圖3 b）水平升高，并沒有因先前長期暴露于 rhGDF15 而產(chǎn)生相關的變化。然后分析貼壁THP1細胞，通過確定單核免疫細胞的激活來可視化炎癥反應（圖3 c、d），發(fā)現(xiàn)雖然拉伸力促進了抗炎反應，減少了 THP1 的激活，但先前的 rhGDF15 暴露阻斷了這種反應。

由于骨形成和成骨細胞活性的激活是拉伸部位的關鍵特征，因此進一步分析了雙軸拉伸應力 24 h 后 hPdLFs 中 ALP 活性的誘導（圖3 e、f）。雖然對照組由于施加拉伸力而顯示出增加的 ALP 活性，但在 rhGDF15 刺激的 hPdLFs 中沒有檢測到這一點，這表明拉伸應力對進一步成骨細胞的激活有限。值得注意的是，由于基線水平增加，rhGDF15 暴露下拉伸刺激的 hPdLFs 中的 ALP 活性仍顯著高于應力對照細胞（圖3 f）。此外，還研究了施加拉伸應力后鈣沉積的形成（圖3 g、h）。雖然先前檢測到的 GDF15-依賴性鈣沉積形成的增加在力應激細胞中也被檢測到，但與未刺激的hPdLFs相比，對照培養(yǎng)組和 rhGDF15-刺激的 hPdLFs 組都沒有顯示出與拉伸力相關的差異。

圖3   長期暴露于 GDF15 的 hPdLFs 顯示出對拉伸應力的抗炎和促成骨機械反應降低。

基于其在調節(jié)對壓縮刺激的促炎反應中的關鍵作用，最后，實驗研究了先前的長期暴露對壓縮應力（2 g/cm2）下 hPdLFs 機械反應的影響。壓縮力促進 hPdLFs 的促炎反應，并通過增加 RANKL 水平和激活破骨細胞來促進骨降解。

對促炎細胞因子 IL-6 和 COX2（圖4 a、b）進行定量分析，雖然沒有檢測到 GDF15 依賴性的 COX2 表達，但在壓縮力下的 rhGDF15 刺激的 hPdLFs 中 IL6 水平顯著增加。值得注意的是，基線水平不會隨著 rhGDF15 暴露而改變。為了研究 IL6 表達的變化是否也會導致炎癥反應的改變，從而導致免疫細胞的激活，研究相應地分析了 THP1 單核細胞的粘附（圖4 c、d），發(fā)現(xiàn) rhGDF15 長期刺激期間壓縮力刺激的 hPdLFs 對單核細胞的激活增加。

通過分析應力刺激下的 hPdLFs 的 RANKL 和 OPG 表達，重點關注對骨吸收破骨細胞激活的可能影響（圖4 e、f）。在對照組中，壓縮力促進了 RANKL 水平的顯著增加和 OPG 水平的顯著降低，在這種情況下，通常通過增加 RANKL-RANK 結合來促進破骨細胞分化。然而，在 rhGDF15 刺激的 hPdLFs 中沒有觀察到這些變化。

為了進一步解決破骨細胞激活在功能上的變化，將預刺激的THP1單核細胞產(chǎn)生的巨噬細胞用壓縮應力刺激的 hPdLFs 的培養(yǎng)上清液培養(yǎng)（圖4 f、g）。與未受壓縮應力的對照組相比，壓縮對照成纖維細胞的培養(yǎng)基上清刺激后，檢測到向單核前破骨細胞和成熟多核破骨細胞的分化增強。然而，與 RANKL 和 OPG 表達數(shù)據(jù)一致，在廣泛暴露于 rhGDF15 的壓縮 hPdLFs 中觀察到破骨細胞活化減少。

這些數(shù)據(jù)表明，GDF15 的長期刺激對人 PdL 成纖維細胞的細胞特性和促炎機械生物學反應具有相關影響，導致由于壓縮力誘導的炎癥增加，但破骨細胞活化減少，可能是通過調節(jié) RANKL/OPG。

圖4     長期暴露于 GDF15 的 hPdLFs 對壓縮刺激的促炎反應增加，對破骨細胞的激活有限。

總之，該研究結果強烈表明，GDF15 對 PdL 成纖維細胞的細胞命運具有相關影響，從而在較長的時間內促進成骨分化。此外，GDF15 似乎影響這些細胞的力相關炎癥機械反應，并隨后影響它們對破骨細胞的激活。由于研究使用簡化的體外加載模型來模擬具有壓縮和拉伸應變的正畸牙齒移動，因此未來的研究應側重于體內的這些發(fā)現(xiàn)。總而言之，以上研究提供了證據(jù)表明，長期升高的 GDF15 水平（例如與特定疾病和衰老相關的水平）確實會影響 PdL 細胞的機械反應性，因此可能與這些患者的正畸治療有關。

參考文獻：L?sch L, Stemmler A, Fischer A, Steinmetz J, Schuldt L, Hennig CL, Symmank J, Jacobs C. GDF15 Promotes the Osteogenic Cell Fate of Periodontal Ligament Fibroblasts, thus Affecting Their Mechanobiological Response. Int J Mol Sci. 2023 Jun 11;24(12):10011. doi: 10.3390/ijms241210011. PMID: 37373159; PMCID: PMC10298702.

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