由動脈粥樣硬化引起的冠狀動脈疾病（CAD）是世界范圍內導致死亡的主要原因。動脈粥樣硬化斑塊優先在血流紊亂（DF）區域形成，如動脈分叉處，其中 DF 引起內皮活化。磷酸酶和肌動蛋白調節因子1（PHACTR1）是高度保守的磷酸酶和肌動蛋白調節因子家族的成員之一，GWAS 研究表明，PHACTR1 位點的 SNP（單核苷酸多態性）與人類 CAD 和心肌梗死的發病、進展和結局顯著相關。最近，有研究報道了 Phactr1-缺失的骨髓在體內加重了動脈粥樣硬化。機制研究表明，巨噬細胞 PHACTR1 參與胞葬作用和巨噬細胞分化，抑制動脈粥樣硬化。

基于此，在同濟大學附屬第十人民醫院心血管內科、美國羅切斯特大學醫學和牙科學院Aab心血管研究所等科研團隊的一項研究中，使用全身和 EC-特異性 Phactr1 KO 小鼠來確定 PHACTR1 在體內動脈粥樣硬化中的作用。PHACTR1 在小鼠 ECs 中表達豐富，研究結果表明，在載脂蛋白E-KO（Apoe?/?）小鼠中，全身或內皮特異性 Phactr1 的敲除顯著減弱了高脂肪、高膽固醇（HF-HC）飲食誘導的動脈粥樣硬化，特別是在 DF 區域。機制研究顯示，內皮細胞 PHACTR1 位于 DF 下的細胞核中，通過抑制 PPARγ（過氧化物酶體增殖物激活受體γ）的轉錄活性來促進 EC 的活化。具體研究成果發表在 Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 期刊題為“Endothelial PHACTR1 Promotes Endothelial Activation and Atherosclerosis by Repressing PPARγ Activity Under Disturbed Flow in Mice"。

首先，實驗建立了 PHACTR1 全身和條件敲除小鼠，為了確定 Phactr1 對動脈粥樣硬化的影響，又雜交建立了 Phactr1?/?Apoe?/? 小鼠，并將實驗組與對照組小鼠喂食 HF-HC 飲食誘導動脈粥樣硬化。令人驚訝的是，敲除 Phactr1 顯著減輕了 Apoe?/? 小鼠的動脈粥樣硬化（圖1 G、L），主動脈竇、主動脈弓內粥樣硬化斑塊面積減少（圖1 G、H），但胸/腹主動脈的動脈粥樣硬化病變面積與對照組小鼠相似（圖1 I、L）。這表明，PHACTR1 是動脈粥樣硬化發展所必需的。

然后，科研人員使用 GTEx 數據庫進行搜索，發現 4 個 PHACTR1 SNPs（rs12526453、rs9349379、rs9369640、rs4714955）與 PHACTR1 mRNA 表達相關，并且在分析的49個組織中，這種關聯主要存在于非病變動脈（包括脛動脈、主動脈和冠狀動脈）中，而不在神經系統、免疫系統或其他組織中，這提示血管 PHACTR1 在動脈粥樣硬化中的作用。PHACTR1 蛋白檢測顯示，其在腦和肺中高表達，而在心臟、肝臟、脾臟、結腸和脂肪組織中沒有檢測到。此外，還觀察到 PHACTR1 在主動脈中表達，特別是在主動脈內膜（主要是ECs）中表達，但在中膜（主要是VSMCs）和外膜中不表達。這些數據暗示了內皮細胞 PHACTR1 在動脈粥樣硬化進展中的潛在作用。

為了具體研究內皮 PHACTR1 在動脈粥樣硬化中的作用，建立了 EC特異性 Phactr1 KO（Phactr1ECKO），在與Apoe?/?小鼠雜交后，生成Phactr1ECKOApoe?/? 和Phactr1f/fApoe?/? 對照小鼠，并用 HF-HC 喂養。與上述結果一致，Phactr1ECKOApoe?/?小鼠主動脈根部動脈粥樣硬化斑塊面積減少。EC特異性 Phactr1 KO  可顯著減輕主動脈弓區域的動脈粥樣硬化，但對胸/腹主動脈沒有作用。主動脈弓區域的血流紊亂促進了動脈粥樣硬化斑塊的形成，研究結果表明，內皮細胞 PHACTR1 可能介導了這一過程。然后對部分頸動脈進行結扎，觸發 LCA 的振蕩流，結果表明，EC特異性 Phactr1 KO 可顯著減弱 DF 相關的動脈粥樣硬化斑塊形成。這證明，內皮細胞 PHACTR1 可以調控 DF 誘導的動脈粥樣硬化。

圖1     全身Phactr1 KO（敲除）減輕Apoe?/?小鼠的動脈粥樣硬化。

接下來，為了研究 PHACTR1 在內皮細胞對血流反應中的作用，實驗檢測了 PHACTR1 在不同剪切應力刺激的 ECs 中的表達。令人驚訝的是，EC PHACTR1 mRNA 的表達不受剪切應力的調節。在體內，Phactr1 mRNA 水平在假手術的 RCAs 和結扎的 LCAs 內膜中相當（圖2 K、L）。體外在層流（LF）高剪切力（12 dynes/cm2）或振蕩DF（±6 dynes/cm2，1 Hz）條件下，HUVECs 中 PHACTR1 mRNA 表達無明顯差異（圖2 M、N）。此外，在 LF 高剪切應力下，PHACTR1 主要集中在細胞質中，而在振蕩 DF 或靜態條件下，PHACTR1 集中在細胞核中（圖2 O、P）。這些數據表明，LF 保留 PHACTR1 在細胞質中，而促動脈粥樣硬化 DF 誘導了 PHACTR1 核易位。

然后研究了內皮細胞 PHACTR1 的分子功能，對小鼠主動脈ECs 進行了 RNA-seq 分析，顯示 Phactr1?/? 小鼠的主動脈內皮細胞中有191個 DEGs，其中 KEGG 通路富集在代謝和炎癥相關通路，而基因本體分析強調了與產熱、血管發育和免疫反應相關的生物學過程。此外，功能分析表明，內皮細胞 Phactr1 的缺失主要影響炎癥相關通路以及與血管功能和免疫反應相關的生物過程的改變。因此，綜合全身和 EC特異性 Phactr1 KO ECs 中 DEGs 的生物信息學分析，研究人員認為內皮細胞 PHACTR1 參與血管功能和炎癥反應。

考慮到 PHACTR1 的核定位，進一步鑒定了與 PHACTR1 相關的潛在轉錄因子，發現 PPARγ 和 RXRα 是過度表達的轉錄因子。在具有潛在 PPARγ/RXRα 結合位點的 DEGs  中，大多數基因上調，這表明，內皮細胞 PHACTR1 的缺失增加了 PPARγ/RXRα 的轉錄活性。然后通過免疫共沉淀法探索了 PHACTR 1、PPARγ 和 RXRα 之間的潛在相互作用。PHACTR1 與 PPARγ 相關，但與 RXRα 無關，提示 PPARγ 是 PHACTR1 的直接效應分子。隨后分析了 PHACTR1 在 PPARγ 信號傳導中的作用，結果表明，PHACTR1 過表達顯著抑制 PPARγ 激動劑 pioglitazone 誘導的激活，且 PHACTR1 通過 LXXXIXXX（I/L）基序與 PPARγ 結合，是一種潛在的 PPARγ 轉錄抑制因子。

圖2     內皮細胞Phactr1的缺失減輕了Apoe?/? 小鼠血流紊亂區域的動脈粥樣硬化。

PPARγ 在動脈粥樣硬化中具有保護作用。研究人員推測 PHACTR1 通過抑制 PPARγ 活性在促動脈粥樣硬化血流中對 EC 激活起關鍵作用。在體外敲除 HUVECs 中 PHACTR1 后，發現靜態條件下，PHACTR1 缺失抑制 HUVECs 中 VCAM-1 和 ICAM-1 的 mRNA 和蛋白水平。應用振蕩 DF 或 LF 處理后，PHACTR1 缺失降低了DF 誘導的 VCAM-1 和 ICAM-1 表達，并抑制 DF 誘導的 PBMCs 對 HUVECs 的粘附。重要的是，PHACTR1 敲低使 DF 下 HUVECs 中 PPARγ 的轉錄活性增加，且恢復了 VCAM-1 和 ICAM-1 的表達，這表明，PHACTR1 介導的 EC 激活是通過抑制 PPARγ 來實現的。在體內實驗中，Phactr1?/? 小鼠 DF 區內皮細胞 VCAM-1 表達顯著降低。在 Apoe?/? 小鼠部分結扎頸動脈引起的動脈粥樣硬化病變中，內皮細胞 Phactr1 缺失使巨噬細胞浸潤減少。這些結果表明，內皮細胞 PHACTR1 通過促進炎癥粘附因子的表達和隨后的白細胞浸潤來促進動脈粥樣硬化的進展。

實驗研究了 PHACTR1 是否通過抑制 PPARγ 信號通路介導動脈粥樣硬化，對 Phactr1ECKOApoe?/? 和 Phactr1f/fApoe?/? 小鼠進行部分頸動脈結扎，喂食 HF-HC，并注射 PPARγ 拮抗劑 GW9662（圖3 A）。在 GW9662 給藥下，兩組小鼠之間的動脈粥樣硬化斑塊具有可比性（圖3 B、C），CD68-陽性巨噬細胞在兩組之間沒有差異（圖3 D、E ），這表明 GW9662 降低內皮 Phactr1 KO 的保護作用。此外，GW9662 還消除了 DF 誘導的 Phactr1 缺失引起的 Vcam1 和 Icam1 表達降低（圖3 F、H）。這些結果表明，PHACTR1 通過抑制 PPARγ 信號介導 EC 激活和動脈粥樣硬化。

圖3    PPARγ拮抗劑GW9662消除了Phactr1缺失對體內內皮活化和動脈粥樣硬化的保護作用。

I  內皮細胞PHACTR1在內皮活化和動脈粥樣硬化中的作用示意圖。層流下，PHACTR1存在于細胞質中，PPARγ抑制炎癥。在流動紊亂的區域，PHACTR1位于細胞核中，作為其轉錄共抑制因子與PPARγ相互作用，上調細胞表面粘附分子的表達。白細胞附著于內皮細胞并浸潤到血管壁，促進動脈粥樣硬化。

總之，該研究證明，內皮細胞 PHACTR1 是一種新的促動脈粥樣硬化分子，通過調節 EC 激活作為 DF 下 PPARγ 的轉錄輔抑制因子。PPARγ 是一個理想的治療靶點，PPARγ 激動劑已成為除代謝外的內皮功能保護劑。然而，由于 PPARγ 的普遍表達和功能的多樣性，其不良反應如心力衰竭和肝功能障礙被觀察到。因此，使用小肽或小分子阻斷內皮細胞 PHACTR1 和 PPARγ 的關聯可能是動脈粥樣硬化等疾病的一種很有前途的治療策略。

參考文獻：Jiang D, Liu H, Zhu G, Li X, Fan L, Zhao F, Xu C, Wang S, Rose Y, Rhen J, Yu Z, Yin Y, Gu Y, Xu X, Fisher EA, Ge J, Xu Y, Pang J. Endothelial PHACTR1 Promotes Endothelial Activation and Atherosclerosis by Repressing PPARγ Activity Under Disturbed Flow in Mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2023 Aug;43(8):e303-e322. doi: 10.1161/ATVBAHA.122.318173. Epub 2023 May 18. PMID: 37199156; PMCID: PMC10524336.

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