The pivotal role of the Hes1/Piezo1 pathway in the pathophysiology of glucocorticoid-induced osteoporosis

Keywords: Bone biology; Bone disease; Osteoporosis; Therapeutics.

糖皮質激素誘導的骨質疏松癥（GIOP）是在接受糖皮質激素治療的自身免疫性疾病患者中觀察到的主要副作用。GIOP 患者的骨折風險與骨密度（BMD）的相關性低于傳統骨質疏松癥患者，這表明糖皮質激素對骨質量和骨量有負面影響。重要的是，機械應力鍛煉已被證明可以增強 GIOP 中的 BMD。雖然單獨使用阿侖膦酸鈉是不夠的，但它與機械應力的結合會顯著提高 BMD。這些發現表明，模擬骨細胞機械應力的治療可能是 GIOP 藥物開發的突破。

目前，使用條件性骨細胞特異性 Piezo1 敲除小鼠的研究表明，Piezo1 的缺失會導致皮質骨參數受損，這突出了 Piezo1 在通過鈣內流和上調 Wnt 通路介導機械誘導骨形成中的重要性。Yoda1 是一種 Piezo1 激動劑，已被證明可以增加完整嚙齒動物的 BMD 并縮短小鼠骨折的愈合時間。然而，Piezo1 激活對疾病進展期間 GIOP 小鼠模型中機械應力的影響尚未見報道。

最近，大阪大學醫學研究院肌肉骨骼再生醫學系、骨科生物材料科學系及運動醫學生物力學系課題組的一項研究旨在闡明機械敏感受體 Piezo1 在 GIOP 發病機制中的作用和機制，并探討了 Piezo1 通路的激活是否可以改善 GIOP 的狀況。研究結果表明，骨細胞和骨膜細胞中 Piezo1 表達和活性的降低有助于 GIOP，而Yoda1 可能通過恢復機械敏感性提供來一種新的治療方法。研究成果發表于 JCI Insight  期刊題為“The pivotal role of the Hes1/Piezo1 pathway in the pathophysiology of glucocorticoid-induced osteoporosis"。

首先，實驗研究了 GIOP 和非 GIOP 骨組織之間的病理生理差異，發現與非 GIOP 患者相比，GIOP 患者組織中空腔隙的比例明顯更高。值得注意的是，GIOP患者骨細胞中Piezo1表達下調，且在 GIOP 組中觀察到 TUNEL 陽性骨細胞的顯著增加。

然后，在 GIOP 模型中研究了 Yoda1 的作用。對小鼠同時給予地塞米松（DEX）和 Yoda1 處理，發現與對照處理組相比，DEX 處理組的骨體積分數（BV/TV）、小梁數（Tb. N.）和皮質厚度（Ct. Th.）顯著降低，但用 DEX 和 Yoda1 聯合治療后，這些影響幾乎緩解。此外，皮質骨孔隙率（Po. tot 和 Po.V）和與骨小梁結構相關的參數在 DEX 組中顯著加劇，但因 Yoda1 而減弱。骨組織形態學分析顯示，DEX 組成骨細胞表面（Ob. S/OS）、類骨質體積（OV/OS）、皮質骨寬度（Ct. Wi.）和皮質骨面積（Ct. Ar.）顯著降低，但Yoda1 有效防止了這些影響。在進一步研究潛在機制時，分析顯示在 DEX 處理組，骨細胞中的 Piezo1 表達顯著降低。這些數據表明，Yoda1 可防止 GIOP 小鼠模型股骨的結構變化和脆弱性。

在體內，對小鼠進行軸向脛骨負荷（13N）以直接評估在 GIOP 背景下受損的機械應力響應（圖1 A）。然而，與對照處理組相比，DEX 處理組對機械負荷沒有反應。相比之下，同時接受 DEX 和 Yoda1 給藥的組在負荷干預后表現出 BV/TV、Tb. N 和 Ct. Th. 的顯著增強，類似于對照處理組（圖1 B、C）。此外，機械負荷顯著降低了對照組和 DEX 和 Yoda1 聯合處理組 Po. tot 水平，增加了礦物質附著率（MAR）、骨形成率（BFR）、骨鈣素-陽性骨膜細胞水平，而 DEX 處理組未發現這種負荷響應（圖1 C-H）。相比之下，無論機械負荷如何，DEX 處理組骨小梁表面的 TRAP 陽性細胞數量都顯著增加，而在對照或 DEX 和 Yoda1 聯合處理組中未觀察到這一點（圖1 I、J）。這些數據表明，Yoda1 減弱了糖皮質激素引起的機械應力的衰減反應。

圖1    Yoda1 逆轉糖皮質激素誘導的機械驅動骨反應的衰減。

在檢查了一系列表明骨細胞有顯著影響的體內數據后，接下來進行了人皮質骨器官培養測定，以闡明基因表達對骨代謝關鍵作用的影響（圖2 A-D）。結果發現，PIEZO1 和 PTGS2 表達水平被 DEX 處理抑制，而 Yoda1 保留了與對照相當的基因表達水平（圖2 A ）。相反，DEX 處理后 SOST 和 RANKL/OPG 比率上調，但在 Yoda1 處理后保持在對照水平（圖2 B、D）。此外，在DEX 和 Yoda1 處理下，WNT16 表達增加（圖2 C）。在蛋白質水平上，MLO-Y4 細胞系中的 Piezo1 表達被 DEX 降低，但 Yoda1 處理可使其得到劑量反應性恢復（圖2 E）。此外，研究了 Piezo1 中的下游磷酸化信號通路，發現 Yoda1 處理上調了 Akt 和 ERK 磷酸化，而這被 DEX 處理下調，且Yoda1 可以促進被 DEX 抑制的 Akt 和 ERK 磷酸化（圖2 F、G）。

定量評估 MLO-Y4 細胞中的鈣內流，發現 Yoda1 可顯著加速 Ca2+ 內流，但與 3 μM DEX 預孵育減弱了這種影響。相比之下，與 1 μM DEX 和更高濃度的 Yoda1（10 μM）共處理可將 Ca2+ 內流恢復到對照水平（圖2 H、I）。進一步研究以探索 Ca2+ 對鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II（CaMKII）磷酸化的下游影響，表明 Yoda1 增強了 CaMKII 磷酸化。有趣的是，選擇性抑制劑 KN-93 對 CaMKII 的抑制導致 Akt 磷酸化的劑量依賴性降低（圖2 J）。骨細胞的形態學分析顯示，DEX 處理后肌動蛋白交聯點增加，但這種增加通過同時使用 DEX 和 Yoda1 而劑量依賴性地減弱（圖2 K、L）。這些數據表明，Yoda1 通過鈣調蛋白激酶II-依賴性 Ca2+ 內流介導對 DEX 誘導的基因表達、骨細胞形態和 Akt 磷酸化變化的抵抗。

圖2    DEX 和 Yoda1 對人皮質骨和 MLO-Y4 細胞的影響。

為了研究糖皮質激素介導的機械應力反應的機制，進行了 RNA-seq 分析，比較了對照處理組和 DEX 處理組在 5 天內的小鼠脛骨軸向負荷反應。在負荷期間，對照組和 DEX 處理組之間的比較基因表達分析顯示，Piezo1 和 Tnfrsf11b（OPG）表達顯著降低，而 DEX 處理組的 Tnfrsf11a（RANK）表達增加。進一步縮小對機械刺激反應的骨細胞特異性基因的關注范圍，分析顯示 Hes1 是 LIPUS 處理后顯示上調的基因。

然后，研究了 Hes1 是否充當 Piezo1 的轉錄因子（圖3）。在 MLO-Y4 細胞中敲低 Hes1 后，發現 Piezo1 表達在 mRNA 和蛋白質水平上均降低（圖3 A 、B）。進一步確認 Hes1 與 Piezo1 基因的結合，發現用 Yoda1 處理顯著增強了 MLO-Y4 細胞中 Hes1 結合區的擴增，而 DEX 處理和 Hes1 敲低則沒有（圖3 C、D）。此外，Piezo1 轉錄活性被 DEX 處理抑制，并被 Yoda1 顯著挽救（圖3 E）。同時，還研究了 DEX 和 Yoda1 處理在基因和蛋白質水平上對 Hes1 表達的影響（圖3 F-H），發現 DEX 處理誘導 Hes1 mRNA 水平呈劑量依賴性降低，而 Yoda1 處理增加 Hes1 mRNA 水平（圖3 F、G）。值得注意的是，發現 Hes1 磷酸化在 DEX 處理下降低，而在 Yoda1 處理下增加（圖3 H）。這些數據表明，Hes1 作為 DEX 和 Yoda1 調節 Piezo1 的調節轉錄因子。

圖3    Hes1 是由 DEX 和 Yoda1 調控的 Piezo1 的調節轉錄因子。

小鼠模型（脛骨）和股骨頸 GIOP 患者的皮質骨（包括骨膜）的翻譯分析揭示了與成骨細胞和軟骨細胞功能相關的 10 個基因的列表。這一發現表明，在 GIOP 中，成骨前細胞向成骨細胞的分化受到抑制。為了進一步研究這一點，比較了從全膝關節置換術和 MC3T3-E1 細胞獲得的人 PDCs 中成骨細胞分化過程中的 Piezo1 表達（圖4 A ）。人 PDCs 在成骨細胞分化的早期顯示 Piezo1 表達上調，這被 DEX 處理抑制。然而，與 DEX 和 Yoda1 的共處理可顯著誘導 Piezo1 表達（圖4 A）。相反，MC3T3-E1 細胞在 Piezo1 表達方面沒有表現出任何顯著變化。

最后，以 PDCs 為重點，對 10 個基因進行定量 PCR 分析，發現 6 個基因 （ACAN、SOX9、SFRP1、SFRP2、SMOC1、COL14A1）在 DEX 處理后顯著下調，但Yoda1 處理顯著逆轉了這種效果（圖 4 B）。進一步評估 DEX 和 Yoda1 處理對 PDCs 成骨細胞分化的影響（圖4 C-F），發現DEX 顯著降低了 ALP 活性，但當 DEX 和 Yoda1 同時使用時，這種影響得到了緩解（圖4 D）。同樣，當 DEX 和 Yoda1 聯合時，通過 DEX 處理顯著降低的茜素紅S 染色顯示出較弱的抑制（圖4 F）。這些數據表明，DEX 和 Yoda1 影響人 PDCs 中 Piezo1 的表達和成骨細胞分化。

圖4     DEX 和 Yoda1 對 PDCs 中 Piezo1 表達和成骨細胞分化的影響。

圖5     Yoda1 通過 Hes1/Piezo1 信號誘導骨細胞功能增強。

Yoda1 通過激活 Hes1 增強 Piezo1 表達，增加骨細胞中的 CaMKII 和 Akt 磷酸化。這導致腔隙-小管網絡（LCN）得到改善，硬化蛋白產生減少，RANKL/OPG 比率平衡，這些影響被 DEX 減弱。

總之，該研究揭示了 GIOP 患者皮質骨組織中 LCN 和 Piezo1 的表達下調。此外，GIOP 小鼠模型顯示對機械應力的反應減弱，突出了 Piezo1 在疾病進展中的關鍵作用。Yoda1 是一種 Piezo1 激活劑，其給藥抵消了 GIOP 模型中受損的機械應力反應。這項研究不僅提供了對 GIOP 病理生理學的見解，還通過靶向 Piezo1 激活和模擬機械應力為該疾病提供了潛在的治療策略。

參考文獻：Ochiai N, Etani Y, Noguchi T, Miura T, Kurihara T, Fukuda Y, Hamada H, Uemura K, Takashima K, Tamaki M, Ishibashi T, Ito S, Yamakawa S, Kanamoto T, Okada S, Nakata K, Ebina K. The pivotal role of the Hes1/Piezo1 pathway in the pathophysiology of glucocorticoid-induced osteoporosis. JCI Insight. 2024 Dec 6;9(23):e179963. doi: 10.1172/jci.insight.179963. PMID: 39641269; PMCID: PMC11623955.

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