E2F1-induced autocrine IL-6 inflammatory loop mediates cancer-immune crosstalk that predicts T cell phenotype switching and therapeutic responsiveness

Keywords: CD4 +/CD8 + T cells; E2F1-STAT3/IL-6 network; Th2-Th1 shift; cancer metastasis; immunomodulation; mathematical modeling; melanoma secretome; tumor microenvironment.

黑色素瘤是一種發(fā)病率越來(lái)越高的皮膚癌，一旦達(dá)到轉(zhuǎn)移階段就會(huì)發(fā)病。一般來(lái)說(shuō)，它被認(rèn)為是一種免疫原性腫瘤，表達(dá)幾種腫瘤特異性以及腫瘤相關(guān)抗原。已在很大一部分患者中檢測(cè)到腫瘤特異性 T 細(xì)胞反應(yīng)。此外，腫瘤特異性 T 細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移可以介導(dǎo)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的持久反應(yīng)。最近，免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）改變了晚期黑色素瘤的治療，在近 50% 的患者中實(shí)現(xiàn)了腫瘤消退和持久的癌癥控制。這些高緩解率強(qiáng)調(diào)了該腫瘤實(shí)體的免疫原性。

黑色素瘤病理學(xué)中的一個(gè)關(guān)鍵表觀遺傳參與者是 E2F1 轉(zhuǎn)錄因子。除了作為細(xì)胞周期、代謝的調(diào)節(jié)因子或通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)響應(yīng)DNA損傷的腫瘤監(jiān)視因子的生理作用外，大量高表達(dá)的E2F1還刺激黑色素瘤和其他幾種腫瘤的轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化。這種轉(zhuǎn)錄因子（TF）通過促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、新血管生成、外滲和基因組不穩(wěn)定來(lái)協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，預(yù)測(cè)疾病惡化和不良患者預(yù)后。

為了探索 E2F1 在侵襲性黑色素瘤細(xì)胞存在下的免疫調(diào)節(jié)中的作用，德國(guó)羅斯托克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心及埃爾朗根-紐倫堡大學(xué)腫瘤免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室研究團(tuán)隊(duì)在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中建立了一個(gè)共培養(yǎng)系統(tǒng)，并利用轉(zhuǎn)錄組和細(xì)胞因子陣列結(jié)合生物信息學(xué)和結(jié)構(gòu)建模，確定了一個(gè)以 IL6 為中心樞紐的 E2F1 依賴性基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究成果發(fā)表于 Frontiers in Immunology 期刊題為“E2F1-induced autocrine IL-6 inflammatory loop mediates cancer-immune crosstalk that predicts T cell phenotype switching and therapeutic responsiveness"。

首先，為了進(jìn)行基因表達(dá)分析，使用人類黑色素瘤組織培養(yǎng)模型，該模型由具有特征性侵襲/轉(zhuǎn)移潛力的不同細(xì)胞系組成，這些細(xì)胞系顯示 E2F1 水平與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)呈正相關(guān)（圖1 B）。在侵襲性細(xì)胞系中敲低 E2F1 后，揭示了 3687 個(gè)顯著差異表達(dá)基因（DEGs）（圖1 C）。在 DEGs 上應(yīng)用 GSEA 表明，在黑色素瘤中敲低 E2F1 后，EMT 和炎癥反應(yīng)的基因集受到抑制（圖1 D），這意味著 E2F1 調(diào)控基因的多效性結(jié)合了其促轉(zhuǎn)移和免疫調(diào)節(jié)活性。值得注意的是，在比較來(lái)自兩個(gè)標(biāo)志集的富集基因后，IL6 成為候選基因（圖1 E）。

將來(lái)自 Transfac 和免疫相關(guān)基因的列表與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相結(jié)合，確定了 165 個(gè)顯著下調(diào)的基因，這些基因可能對(duì)免疫調(diào)節(jié)有影響（圖1 F）。對(duì)已鑒定基因的 STRING 分析表明，存在高度互連的網(wǎng)絡(luò)，包括 E2F1、MYC、CD274（PD-L1）、EZH2 和 IL6（圖1 G）。有趣的是，IL6 在 E2F1 消融后表現(xiàn)出下降（圖1 C），在與細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、Th2 細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞遷移調(diào)控相關(guān)的基因表達(dá)亞簇中占據(jù)中心樞紐位置（圖1 H）。這些數(shù)據(jù)支持，E2F1 與免疫調(diào)節(jié)之間的功能聯(lián)系，并強(qiáng)烈表明 IL-6 是該轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性的關(guān)鍵因子。隨后對(duì) IL-6 表達(dá)和分泌的分析清楚地驗(yàn)證了其與內(nèi)源性 E2F1 表達(dá)的正相關(guān)（圖1 I）。進(jìn)一步檢測(cè)侵襲性黑色素瘤細(xì)胞中 E2F1 和 IL-6 以及間充質(zhì)或上皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，并分析它們的相關(guān)性（圖1 J-L），發(fā)現(xiàn)IL-6 通過增強(qiáng)黑色素瘤細(xì)胞的 EMT 和侵襲性來(lái)促進(jìn) E2F1 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移。

為了進(jìn)一步評(píng)估 IL6 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，使用 ChIP-seq 數(shù)據(jù)篩選 IL6 基因上游 10,000 bp 的片段來(lái)搜索 E2F1 結(jié)合簇，并在翻譯起始位點(diǎn)近端的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域中心發(fā)現(xiàn)了一個(gè)主要的 E2F1 簇。值得注意的是，該區(qū)域還包含一個(gè) STAT3 簇。據(jù)報(bào)道，STAT3 和 E2F1 可以根據(jù)細(xì)胞環(huán)境產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄協(xié)同作用，研究結(jié)果也證實(shí)了 E2F1 和 STAT3 對(duì) IL6 啟動(dòng)子的協(xié)同增強(qiáng)作用。

圖1    轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中鑒定 E2F1 誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。

由于 E2F1 通過 IL-6 協(xié)調(diào)免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)（圖1 G），因此，接下來(lái)研究了 IL-6 對(duì)癌癥免疫串?dāng)_的影響，建立一個(gè)間接共培養(yǎng)系統(tǒng)，將高表達(dá) E2F1 與 E2F1敲低（E2F1-KD）黑色素瘤細(xì)胞系以單一培養(yǎng)的形式或與來(lái)自健康供體的 CD4 + 或 CD8 + T 細(xì)胞共培養(yǎng)（圖2 A）。通過活/死染色驗(yàn)證共培養(yǎng)的黑色素瘤和免疫細(xì)胞的活力（圖2 B）。

與單一培養(yǎng)的 CD8+（左圖）或 CD4+（右圖）T 細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞在上清液中顯示出高濃度的 IL-6（圖2 C）。重要的是，當(dāng)腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞一起培養(yǎng)時(shí)，IL-6 水平顯著增加，這表明黑色素瘤和 T 細(xì)胞之間存在正反饋回路。盡管 E2F1 的缺失主要抵消了這種作用，但 IL-6 在共培養(yǎng)條件下仍然可以檢測(cè)到，并且只能通過直接抑制來(lái)降低。事實(shí)上，在 T 細(xì)胞存在的情況下，聯(lián)合IL-6 抑制劑和 E2F1-KD 處理以降低升高的細(xì)胞因子水平是必要的（圖2 C），而不影響細(xì)胞活力。

由于 E2F1 對(duì)腫瘤細(xì)胞中 GRNs 的影響以及觀察到的 IL-6 分泌的有趣變化，研究人員想知道黑色素瘤和 T 細(xì)胞的基因表達(dá)譜在多大程度上發(fā)生了改變，以及 E2F1-KD 是否可以在抗腫瘤免疫反應(yīng)的意義上對(duì) T 細(xì)胞的基因組程序產(chǎn)生積極影響。因此，對(duì)來(lái)自單培養(yǎng)和共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的腫瘤和免疫細(xì)胞進(jìn)行了高通量陣列分析（圖2 A）。

來(lái)自共培養(yǎng)的 CD4 + T 細(xì)胞和人皮膚黑色素瘤細(xì)胞系 SK-Mel-147 對(duì)照與其相應(yīng)的單一培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)錄組的比較顯示，總共有 9453 個(gè)和 4521 個(gè) DEGs（圖2 D），表明通過細(xì)胞因子介導(dǎo)的串?dāng)_，在富含E2F1的黑色素瘤和免疫細(xì)胞中強(qiáng)烈地誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄變化。值得注意的是，在共培養(yǎng)條件下，IL6 在黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)烈（圖2 D），這也驗(yàn)證了圖中檢測(cè)到的 IL-6 分泌增加，并支持存在活性反饋回路。E2F1 敲低將兩種細(xì)胞類型中基因表達(dá)的這些變化嚴(yán)重分降低到 1462（CD4+）和 1708（SK-Mel-47 E2F1-KD）DEGs（圖2 E），強(qiáng)調(diào)了 E2F1 在腫瘤和免疫細(xì)胞之間的串?dāng)_中的調(diào)節(jié)作用。

為了進(jìn)一步研究已鑒定基因的潛在生物學(xué)功能，對(duì) DEGs（圖2 D）進(jìn)行了 GO 富集分析，發(fā)現(xiàn)，與 SK-Mel-147 共培養(yǎng)的 CD4+ 中，1315 個(gè)上調(diào)基因主要與 T 細(xì)胞活化和 MHC-II 相關(guān)反應(yīng)增加（即抗原加工和呈遞）等過程和通路相關(guān)（圖2 F），表明 T 細(xì)胞功能。相比之下，1662 個(gè)下調(diào)基因與單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的趨化性有關(guān)（圖2 F），表明與先天免疫細(xì)胞的定向通訊受損。重要的是，該分析還揭示了與 IFN-γ 和 TNF-α 反應(yīng)相關(guān)的基因抑制，這是已知可促進(jìn)抗腫瘤反應(yīng)的 CD4+ Th1 分化的兩個(gè)關(guān)鍵介質(zhì)。這與與 Th1 發(fā)育相關(guān)的 ERK1/ERK2 通路相關(guān)基因的抑制一致（圖2 F）。在黑色素瘤細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn) 331 個(gè)上調(diào)基因的抗原加工/呈遞和免疫反應(yīng)的正調(diào)節(jié)得分很高（圖2 G），這與黑色素瘤的高度活躍免疫表型一致，而下調(diào)的基因主要參與神經(jīng)元過程（圖2 G）。令人驚訝的是，在上調(diào)的免疫激活基因中，發(fā)現(xiàn)了幾種免疫抑制因子，如 CCL2，一種有效的 Th2 細(xì)胞趨化劑，以及檢查點(diǎn)抑制劑 CD274（圖2 G），如圖1 G 所示，它通過 IL6 簇連接到已識(shí)別的免疫調(diào)節(jié) E2F1 網(wǎng)絡(luò)。

圖2    E2F1 依賴性串?dāng)_對(duì)黑色素瘤和 CD4 + T 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的影響。

考慮到 E2F1 通過 IL-6 的大幅上調(diào)和轉(zhuǎn)錄水平的變化對(duì)周圍環(huán)境的影響，使用 TIMER 2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)分析了原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性皮膚癌中 E2F1 的表達(dá)與免疫細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)之間的潛在相關(guān)性。基于功能注釋和通路富集（圖2 F ），首先研究了單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的豐度。有趣的是，發(fā)現(xiàn) E2F1 與原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性患者樣本中的單核細(xì)胞呈有限的負(fù)相關(guān)（圖3 A、B）。然而，在兩個(gè)癌癥組中都沒有明顯的中性粒細(xì)胞或嗜酸性粒細(xì)胞的存在，證實(shí)了實(shí)驗(yàn)之前的發(fā)現(xiàn)，即這些免疫細(xì)胞類型的趨化性相關(guān)基因下調(diào)（圖2 E）。

更重要的是，這些數(shù)據(jù)顯然支持 E2F1 及其靶點(diǎn) IL-6 對(duì) Th1/Th2 發(fā)育的強(qiáng)烈影響，如 Th2 細(xì)胞因子的產(chǎn)生、ERK1/2 通路的下調(diào)、IFN-γ反應(yīng)或 CCL2 在黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)。令人驚訝的是，E2F1 與原發(fā)腫瘤中的 Th2 浸潤(rùn)呈顯著的正相關(guān)，而 IL6 沒有影響（圖3 C）。相比之下，轉(zhuǎn)移性樣本僅與 Th2 細(xì)胞表現(xiàn)出中等相關(guān)性，但也與 Th1 相關(guān)，這可能支持免疫刺激和免疫抑制機(jī)制的共現(xiàn)。然而，IL6 可以進(jìn)一步促進(jìn) Th2，如晚期黑色素瘤中 Th2 豐度的增加和隨之而來(lái)的 Th1 細(xì)胞減少所表明的那樣（圖3 C）。這種轉(zhuǎn)變通過 E2F1 的輔因子 STAT3 的表達(dá)進(jìn)一步放大，該輔因子 STAT3 持續(xù)抑制 Th1。此外，CD274 在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤中同時(shí)阻斷 Th1 并促進(jìn) Th2 浸潤(rùn)（圖3 D）。

為了驗(yàn)證 E2F1 依賴性 Th2 轉(zhuǎn)移，使用從黑色素瘤免疫細(xì)胞共培養(yǎng)中獲得的上清液進(jìn)行細(xì)胞因子陣列，特別關(guān)注 1 型和 2 型細(xì)胞因子（圖3 E、F），發(fā)現(xiàn)CD4+-SK-Mel-147 共培養(yǎng)的上清液顯示所有檢測(cè)到的 2 型細(xì)胞因子顯著增加，其中 IL-6 表現(xiàn)出強(qiáng)烈的反應(yīng)。引人注目的是，E2F1 的缺失導(dǎo)致大多數(shù)促炎蛋白的顯著減少，但不影響 1 型細(xì)胞因子（圖3 F）。與之前的數(shù)據(jù)一致，在高表達(dá) E2F1 黑色素瘤共培養(yǎng)物中測(cè)得的 IL-6 水平急劇升高（圖3 E）在 E2F1-KD 下顯著降低（圖3 F）。這些結(jié)果提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，表明 E2F1/IL-6 表達(dá)增加通過 2 型細(xì)胞因子觸發(fā) Th2 驅(qū)動(dòng)的炎癥，而 Th1 細(xì)胞活性受到抑制，建立了免疫抑制環(huán)境。

圖3     E2F1 對(duì)與 T 細(xì)胞共培養(yǎng)中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞因子釋放的影響。

由上述結(jié)果可知，STAT3 與 E2F1 共同參與 IL-6 表達(dá)，對(duì)黑色素瘤患者的 Th2/Th1 平衡起著關(guān)鍵作用。為了驗(yàn)證分子機(jī)制和癌癥免疫串?dāng)_的動(dòng)力學(xué)，研究人員最終推導(dǎo)出了一個(gè)基于核心腫瘤-免疫相互作用網(wǎng)絡(luò)的數(shù)學(xué)常微分方程（ODE）模型，該模型描述了 E2F1-STAT3/IL-6/IL6R 信號(hào)通路的激活以及 E2F1 和 STAT3 之間相互作用對(duì) IL-6 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響（自體和旁分泌激活；圖4 A ）。通過修改E2F1表達(dá)值的迭代模擬發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ) STAT3 激活下，黑色素瘤細(xì)胞中 E2F1 水平的增加可以觸發(fā) IL-6 的表達(dá)和分泌（圖4 B）。模擬表明，黑色素瘤細(xì)胞高水平的 IL-6 分泌可以通過高水平的 E2F1、高水平的 STAT3 或中等水平的兩種 TFs 來(lái)實(shí)現(xiàn)（圖4 C）。

此外，還模擬了黑色素瘤分泌的 IL-6 對(duì) TME 中存在的 CD4 + T 細(xì)胞的影響（圖4 A），表明高表達(dá) E2F1 黑色素瘤細(xì)胞分泌的 IL-6 足以觸發(fā) CD4+ 免疫細(xì)胞中 IL-6/IL6R/STAT3 軸的激活，這也可能觸發(fā)其他炎癥因子的分泌。重要的是，該模型在 IL-6 介導(dǎo)的自分泌激活誘導(dǎo)的 CD4+ 反應(yīng)中顯示出超敏感性，因此能夠?qū)颊邤?shù)據(jù)進(jìn)行以治療為導(dǎo)向的解釋。

圖4     黑色素瘤-CD4 + T 細(xì)胞與 E2F1-STAT3/IL-6/IL6R 軸串?dāng)_的數(shù)學(xué)模型和概述。

總之，該研究確定了一個(gè)以 IL6 為中心樞紐的 E2F1 依賴性基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。E2F1 誘導(dǎo)的 IL-6 分泌釋放出自分泌炎癥反饋回路，驅(qū)動(dòng)侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。IL-6 激活的 STAT3 與 E2F1 物理相互作用，并通過結(jié)合 E2F1-STAT3 響應(yīng)性啟動(dòng)子元件協(xié)同增強(qiáng) IL-6 表達(dá)。引人注目的是，E2F1 缺失減少了典型 2 型細(xì)胞因子的分泌，從而啟動(dòng)了 Th2 到 Th1 表型向抗腫瘤免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)變。這項(xiàng)研究解決了腫瘤相關(guān)微環(huán)境在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中的重要分子影響，并將為改進(jìn)未來(lái)的癌癥治療做出重大貢獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)：Spitschak A, Dhar P, Singh KP, Casalegno Gardu?o R, Gupta SK, Vera J, Musella L, Murr N, Stoll A, Pützer BM. E2F1-induced autocrine IL-6 inflammatory loop mediates cancer-immune crosstalk that predicts T cell phenotype switching and therapeutic responsiveness. Front Immunol. 2024 Oct 31;15:1470368. doi: 10.3389/fimmu.2024.1470368. PMID: 39544930; PMCID: PMC11560763.

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