Endothelial IGFBP6 suppresses vascular inflammation and atherosclerosis

KWS：IGFBP6；vascular inflammation；atherosclerosis

動脈粥樣硬化通常發生在血流紊亂（DF）區域，例如動脈分支或彎曲處。DF 通過改變生化信號和基因表達來改變內皮細胞（ECs）的形態和細胞骨架，最終導致內皮功能障礙。相反，單向層流（UF）通常發生在血管的直線部分，暴露于該區域的血管可以防止動脈粥樣硬化。

DF 通過誘導 ECs 炎癥來引發內皮功能障礙。炎癥導致內皮損傷，進而促進各種粘附分子的表達，促進循環白細胞向活化內皮細胞的粘附和遷移，最終導致斑塊形成。為了確定 ECs 中新的抗炎靶點，從暴露于動脈粥樣硬化保護療法（他汀類藥物和 UF）的人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）以及來自不穩定斑塊的冠狀動脈疾病（CAD）患者中選擇 RNA 測序（RNA-seq）數據集，發現胰島素樣生長因子結合蛋白 6（IGFBP6）可能是一種潛在的血管穩態相關分子。以往研究表明，IGFBP6 在調節細胞周期、細胞增殖和遷移中起著至關重要的作用。然而，IGFBP6 在內皮穩態和動脈粥樣硬化中的確切作用和機制仍不清楚。

最近，中國科學技術大學生命科學與醫學部、美國芝加哥大學醫學系、英國巴茨威廉哈維研究所及德國巴特瑙海姆馬克斯·普朗克心肺研究所等團隊的一項聯合研究證明，Igfbp6 的全身性或 EC 特異性缺失加速了小鼠動脈粥樣硬化的進展，而 Igfbp6 的 EC 特異性過表達改善了動脈粥樣硬化。從機制上講，IGFBP6 通過穹窿體主蛋白（MVP）-c-Jun N 末端激酶（JNK）/核因子κB（NF-κB）通路抑制內皮細胞炎癥和單核細胞粘附。研究成果在線發表于 Nature Cardiovascular Research  期刊題為“Endothelial IGFBP6 suppresses vascular inflammation and atherosclerosis"。

通過比較CAD 患者樣本數據集，觀察到與相鄰的非斑塊組織相比，頸動脈斑塊中的 IGFBP6 mRNA 表達降低。此外，不穩定斑塊的 IGFBP6 mRNA 水平低于穩定斑塊。從STARNET數據庫中驗證CAD 患者和健康個體組織和器官中 IGFBP6 的表達，結果表明，與健康對照相比，CAD 患者動脈粥樣硬化主動脈組織中 IGFBP6 的表達顯著降低。進一步擴展其在人類患者中的研究轉化意義，分析了 IGFBP6 在對照受試者和 CAD 患者中的動脈表達，發現與健康的冠狀動脈相比，IGFBP6 在有動脈粥樣硬化斑塊的人冠狀動脈內膜中的表達水平降低，且在動脈粥樣硬化斑塊患者血清中的水平也降低。

由于 IGFBP6 的表達被 UF 上調，因此探索了 IGFBP6 在響應不同類型剪切應力中的潛在作用。首先通過對 DF 和 UF 處理的 ECs 的微陣列數據來檢測其在 HUVECs 中的表達，發現與 UF 處理相比，DF 處理的 HUVECs 中 IGFBP6 的 mRNA 表達較低。

為了驗證體內 IGFBP6 表達的血流依賴性調控，在部分頸動脈結扎（PCL）手術小鼠的頸動脈中獲得了內膜 RNA。qRT-PCR 分析顯示，PCL 4 天后，與假手術組相比，左頸動脈（LCA；暴露于 DF）內皮中 Igfbp6 mRNA 的表達降低。免疫熒光染色同樣顯示，PCL 后 IGFBP6 蛋白表達降低，且主動脈弓內曲率（AA；DF 區域）中的 IGFBP6 蛋白表達低于胸主動脈（TA；UF 區域）。這些結果表明，IGFBP6 作為一種血流響應基因，可能在血管穩態和動脈粥樣硬化保護中發揮重要的生物學功能。

為了驗證 IGFBP6 是否在體內抑制動脈粥樣硬化，構建 Igfbp6 全身敲除小鼠（Igfbp6-/-）。與野生型（WT）小鼠相比，在 Igfbp6?/? 小鼠的組織和器官（脂肪組織、肝臟、心臟、肺、結腸和主動脈）中觀察到 Igfbp6 mRNA 表達降低（圖1 a）。隨后，用AAV8-Pcsk9 D377Y 感染雄性8 周齡 Igfbp6-/- 小鼠及其 WT 對照小鼠，同時飼喂高膽固醇飲食（HCD）誘導動脈粥樣硬化模型，之后進行 PCL 手術，并繼續 HCD 喂養 3 周（圖1 b）。

在血漿總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、天冬氨酸轉氨酶（AST）或丙氨酸轉氨酶（ALT）的水平上，未觀察到 Igfbp6?/? 小鼠與其對照小鼠之間的顯著差異。由于 IGFBP6 是一種分泌蛋白，使用 ELISA 測量 Igfbp6-/- 小鼠血清中的 IGFBP6 水平，發現其在敲除小鼠中耗盡（圖1 c）。免疫熒光染色還顯示，IGFBP6 在 Igfbp6-/- 小鼠的 RCA 中急劇降低（圖1 d）。值得注意的是，與 WT 小鼠相比，Igfbp6?/? 小鼠 LCA 中動脈粥樣硬化斑塊的面積增加（圖1 e）。油紅O 和免疫熒光染色顯示，Igfbp6?/? 小鼠 LCA 內皮層脂質積累面積和血管細胞粘附分子-1（VCAM-1）陽性增加（圖1 f、g）。這些發現表明，Igfbp6 的缺失會增加 DF 誘導的小鼠動脈粥樣硬化病變。

圖1     IGFBP6 缺失會增加接受 PCL 手術的小鼠的動脈粥樣硬化。

接下來，為了進一步探索 EC 衍生的 IGFBP6 在高膽固醇血癥小鼠動脈粥樣硬化發展中的作用，構建了內皮細胞特異性IGFBP6 敲除小鼠（Igfbp6ECKO）。與 Igfbp6WT 對照小鼠相比，Igfbp6ECKO 小鼠主動脈內膜而非中膜層的 Igfbp6 mRNA 水平降低。ELISA 還表明，Igfbp6ECKO 小鼠血清中 IGFBP6 的水平顯著降低。在 HCD 喂養 12 周結束時，Igfbp6ECKO 小鼠和 Igfbp6WT 小鼠之間在體重、血糖或血漿 TC、TG、HDL-C、LDL-C、AST 或 ALT 水平方面未觀察到表型差異。然而，小鼠主動脈和主動脈竇的油紅 O 染色顯示，與相應的對照相比，雄性和雌性 Igfbp6ECKO 小鼠的動脈粥樣硬化斑塊面積顯著增加。此外，Igfbp6 的 EC 特異性缺失也增加了頭臂動脈斑塊的積累，斑塊中的膠原蛋白含量降低，病變壞死核心的大小增加，且主動脈斑塊中 α-SMA 表達降低，而 CD68+ 巨噬細胞含量增加。這些數據表明，Igfbp6 的 EC 特異性敲除會增加雄性和雌性小鼠的動脈粥樣硬化，并增加斑塊不穩定性的特征。

為了關聯 IGFBP6 水平和斑塊進展，建立了從動脈粥樣硬化早期到晚期的進行性動脈粥樣硬化小鼠模型。與 C57BL/6J 對照小鼠相比，ApoE-/- 小鼠的主動脈和主動脈竇的斑塊面積隨著斑塊的進展而顯著增加（圖2 a）。實驗觀察到，與健康的主動脈相比，ApoE-/- 小鼠斑塊中 IGFBP6 的表達降低（圖2 b）。在飼喂 HCD 6-18 周的 ApoE-/- 小鼠的血清中也獲得了類似的數據（圖2 c）。這些數據表明，IGFBP6 在動脈粥樣硬化進展過程中表達水平降低。

然后，確定 ECs 中 IGFBP6 的過表達是否能改善動脈粥樣硬化（圖2 d）。與對照小鼠相比，在 AAV9-EC-Igfbp6 小鼠的主動脈根部和主動脈內膜中觀察到 IGFBP6 水平升高（圖2 e、f）。AAV9-EC-Igfbp6 小鼠和對照小鼠在體重、血糖和血漿 TC、TG、HDL-C、LDL-C 和 AST 水平方面沒有觀察到明顯的表型差異，而 ALT 水平趨于降低。小鼠主動脈、主動脈根部和頭臂動脈的油紅 O 染色顯示，Igfbp6 的 EC 特異性過表達減少了動脈粥樣硬化斑塊面積（圖2 g-i）。此外，Igfbp6 的 EC 特異性過表達增加了動脈粥樣硬化斑塊中的膠原蛋白表達（圖2 j），減小了斑塊中壞死核心區域的大小（圖2 k），頭臂動脈和主動脈根部也表現出 α-SMA 表達增加，CD68 + 巨噬細胞浸潤減少（圖2 l、m）。這些結果表明，Igfbp6 的 EC 特異性過表達改善了小鼠的動脈粥樣硬化病變，并增強了斑塊穩定性的幾個特征。

圖2     IGFBP6 的 EC 特異性過表達可改善 ApoE-/- 小鼠的動脈粥樣硬化。

隨后，進一步探討了 IGFBP6 在內皮炎癥中的作用。在用各種促炎因子（IL-1α、IL-1β、TNF、IFN-γ和LPS）處理后，觀察到在各種炎癥因子處理下 IGFBP6 mRNA 水平顯著下調（圖3 a）。為了評估 IGFBP6 是否在 ECs 中發揮抗炎作用，首先對 HUVECs 和人主動脈內皮細胞（HAECs）進行了實驗，分別敲低或過表達 IGFBP6，并評估它們對 TNF 誘導的炎癥反應的影響（圖3 b）。在 IGFBP6 沉默的 HUVECs 中，VCAM-1 、ICAM-1和 SELE的 mRNA 和蛋白質水平均顯著升高（圖3 c、d）。相比之下，在過表達 IGFBP6 的 HUVECs 中，這些分子的 mRNA 和蛋白水平均降低（圖3 e、f）。在功能相關性方面，IGFBP6 的敲低增加了 THP-1 單核細胞與 HUVECs 的粘附（圖3 g），而 IGFBP6 的過表達抑制了它們的粘附（圖3 h）。

RNA-seq 數據表明，IGFBP6 過表達導致與 TNF 信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化相關的 DEGs 發生變化。具體來說，IGFBP6 在 ECs 中的過表達降低了粘附分子（VCAM-1、ICAM-1 和 SELE）和趨化因子（CCL2、CXCL1、CXCL3、CXCL6 和 CXCL8）的 mRNA 表達。隨后，研究了 IGFBP6 是否在暴露于 DF 的 ECs 中發揮抗炎作用，發現與 UF 相比，暴露于 DF 上調了 HUVECs 中 ICAM-1 和 VCAM-1 基因表達，而 IGFBP6 過表達則逆轉了這一點（圖3 i）。同時，IGFBP6 過表達逆轉了 DF 誘導的 VCAM-1 蛋白上調（圖3 j）。因此，IGFBP6 的過表達抑制了 THP-1 單核細胞與暴露于 DF 的 HUVECs 的粘附（圖3 k）。

然后，通過活體顯微鏡評估了 Igfbp6 是否影響體內白細胞粘附，結果觀察到，Igfbp6 的 EC 特異性敲除增加了小鼠腸系膜血管中滾動和粘附的白細胞的數量，并減慢了白細胞的運動（圖3 l）。這些數據表明，IGFBP6 減輕了炎癥因子誘導的內皮炎癥，并防止白細胞與活化內皮細胞的粘附，這進一步鞏固了 IGFBP6 對內皮功能障礙的保護作用。

圖3     IGFBP6 調節 EC 炎癥。

KLF2 是一種對剪切應力有反應的主轉錄因子，可調節與血管穩態相關的一系列機械敏感基因的表達。因此，實驗研究了 KLF2 是否可以轉錄調節 ECs 中 IGFBP6 的表達，結果在他汀類藥物和白藜蘆醇處理的 ECs 中觀察到 KLF2 和 IGFBP6 mRNA 表達的濃度依賴性上調。

通過敲低或過表達 HUVECs 中的 KLF2，發現 KLF2 正向調節 IGFBP6 的 mRNA 表達。此外，通過構建各種質粒載體，發現過表達 KLF2 增加了 WT IGFBP6 啟動子和 MT1 IGFBP6 啟動子的活性，但沒有增加 MT2 IGFBP6 啟動子的活性，表明 KLF2 可以增強 IGFBP6 啟動子的活性，并與 IGFBP6 啟動子中的 GGGTG 序列結合。染色質免疫沉淀-PCR 還證實 KLF2 與 IGFBP6 啟動子區域結合。這些發現共同表明，IGFBP6 是 KLF2 的真正轉錄靶點。由于 KLF4 與 KLF2 一樣調節大量重疊基因，因此實驗還證實 KLF4 也調節 IGFBP6 的表達。結果表明，IGFBP6 也可能是 KLF4 的轉錄靶點。

最后，為了揭示 IGFBP6 在 ECs 中抗炎作用的直接機制，從過表達的 ECs 中沉淀 IGFBP6，然后進行質譜分析。根據蛋白質特異性肽段和分數，MVP 的得分很高（圖4 a）。免疫共沉淀測定揭示了 ECs 中外源性 IGFBP6 和內源性 MVP 之間的相互作用（圖4 b）。在 HEK293T 細胞中共轉染 Flag 標記的 IGFBP6 和 HA 標記的 MVP 顯示，IGFBP6 與 MVP 相互作用（圖4 c）。免疫熒光染色還顯示，IGFBP6 與 MVP 共定位于 ECs 的細胞質中（圖4 d）。通過表面等離子體共振（SPR）實驗，發現 MVP 可以以濃度依賴性方式直接與 IGFBP6 蛋白結合（圖4 e）。

先前的研究表明，MVP 通過抑制巨噬細胞中的 TNF 受體相關因子6（TRAF6）-NF-κB 和凋亡信號調節激酶1（ASK1）-JNK 信號通路來抑制炎癥，從而保護小鼠免受動脈粥樣硬化。實驗表明，HUVECs 中的 MVP 沉默增加了 ICAM-1 和 SELE mRNA 表達水平，增加了單核細胞對 HUVEC 的粘附，并增加了 JNK 和 p65 的磷酸化（圖4 f）。此外，通過在不同時間點用 TNF 處理 HUVECs 和 HAECs 來誘導內皮細胞炎癥。在 IGFBP6 沉默的 HAECs 中，絲氨酸 183 和蘇氨酸 185 位點磷酸化 JNK 的表達增加，而 IGFBP6 的過表達顯著降低磷酸化 JNK 和 p65 的表達（圖4 g、h）。在 HUVECs 中獲得了類似的結果（圖4 i、j）。有趣的是，MVP 沉默逆轉了 IGFBP6 對單核細胞粘附（圖4 k）、JNK 和 p65 磷酸化（圖4 l）的預防作用。小鼠主動脈竇的免疫熒光染色顯示，Igfbp6 的 EC 特異性敲除增加了斑塊中的 JNK 磷酸化，而 Igfbp6 的 EC 特異性過表達表現出相反的效果（圖4 m、n）。

圖4    IGFBP6 與 MVP 相互作用，并通過 MVP 依賴性p65 和 JNK 磷酸化抑制來抑制內皮炎癥。

為了確定 IGFBP6 通過 MVP 抑制炎癥的具體機制，探索了 IGFBP6-MVP 相互作用下游的機制細節。在以前的報道中，巨噬細胞中的 MVP 通過抑制 ASK1 和 TRAF6 的二聚化來抑制下游 JNK 和 p65 激活。實驗又進一步驗證了 IGFBP6 也與 ASK1 結合并增加 MVP 和 ASK1 之間的相互作用。最重要的是，IGFBP6 促進了 MVP 與 ASK1 的結合，進一步抑制了 ASK1 二聚化。因此，IGFBP6 下調 ASK1 二聚化下游 JNK 的磷酸化。

然后，采用基于 AlphaFold 3 的分子對接來預測 IGFBP6 和 MVP 的結合位點，結果表明，E48 或 R65 或 R103 的單個突變可以不同程度地輕微降低 IGFBP6 和 MVP 之間的相互作用，而所有三個潛在結合位點的突變可以顯著抑制 IGFBP6 和 MVP 之間的結合。此外，WT IGFBP6 的過表達可以顯著抑制 ECs 的炎癥，而這種抗炎作用在感染 IGFBP6 三重突變體的 ECs 中減弱，表明這三個結合位點至少部分參與了 IGFBP6-MVP 信號軸的抗炎傳遞。這些結果表明，IGFBP6 通過與 MVP 結合發揮抗炎作用。進一步探索了 IGFBP6 和 MVP 之間細胞外相互作用的可能性，結果證明了，IGFBP6 主要通過與細胞內 MVP 而不是細胞外 MVP 相互作用來發揮其抗炎作用。

這些數據表明，IGFBP6 通過與細胞內 MVP 的相互作用抑制 JNK 和 p65，從而減少粘附分子的表達并抑制單核細胞與 ECs 的粘附，最終對抗內皮炎癥。

圖5   圖形概要

IGFBP6 是一種新型內皮穩態相關分子，具有機械響應性，通過與細胞內 MVP 結合并抑制 JNK 和 p65 磷酸化賦予抗炎和動脈粥樣硬化保護作用。

總之，該研究表明，IGFBP6 具有機械響應性、抗炎性和動脈粥樣硬化保護性作用。內皮細胞 IGFBP6 在基因或藥理水平上的升高可能代表了降低 CAD 殘余炎癥風險的策略。

參考文獻：Su M, Zhao W, Jiang H, Zhao Y, Liao Z, Liu Z, Xu M, Jiang S, Wu L, Yang Y, Wang Z, Zeng Z, Fang Y, Tang C, Miller CL, Evans PC, Wang L, Banach M, Jo H, Berk BC, Offermanns S, Huang Y, Ge J, Xu S, Weng J. Endothelial IGFBP6 suppresses vascular inflammation and atherosclerosis. Nat Cardiovasc Res. 2025 Feb;4(2):145-162. doi: 10.1038/s44161-024-00591-0. Epub 2025 Jan 10. PMID: 39794479; PMCID: PMC11825279.

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