Endothelial-mesenchymal crosstalk drives osteogenic differentiation of human osteoblasts through Notch signaling

Keywords: Co-culture; Endothelial cells; Notch signaling; Osteoblasts; Osteogenic differentiation.

骨形成與血管生成密切相關。內皮細胞（EC）和骨形成細胞，如成骨細胞（OB）之間的相互作用對正常骨發育和修復至關重要。通常認為，EC 與骨組織細胞之間相互作用的主要機制與旁分泌信號有關。在骨組織中，ЕС 促進特定信號通路的激活，通過旁分泌機制刺激成骨細胞分化。相反，內皮通常會阻止血管系統中的鈣化，與 EC 功能相關的疾病會導致微環境的異常變化、內皮一氧化氮（NO）分泌減少和成骨因子分泌增加，從而導致異常成骨分化和異位鈣化。

然而，似乎不僅旁分泌因子對鈣化過程有顯著影響，考慮旁分泌信號在 EC 與可發生成骨分化的細胞之間相互作用中的影響也很重要。鄰分泌（Juxtacrine）信號傳導揭示了可通過位于細胞表面的各種蛋白質分子進行細胞間相互作用。在血管成骨的背景下，它可以通過以下方式實現：通過細胞粘附分子—整合素和鈣粘蛋白與細胞外基質蛋白（ECM）結合；通過間隙連接—連接蛋白和配體-受體相互作用，即通過 Notch 信號通路。

揭示內皮細胞和成骨細胞相互作用的復雜機制對于理解骨內穩態和心血管組織異常礦化過程之間的平衡至關重要。最近，俄羅斯圣彼得堡 RAS 細胞學研究所及Vreden國家創傷學和骨科醫學研究中心團隊探索了體外成骨細胞分化的背景下介導 EC 和 OB 之間串擾的旁分泌和鄰分泌機制，研究證明，在成骨分化誘導過程中，人成骨細胞和內皮細胞之間是否存在直接接觸可能影響骨誘導或骨抑制作用。這一新發現奠定了 Notch 信號以及成骨細胞和內皮細胞之間的物理相互作用在成骨分化中的關鍵作用，并為基于 Notch 信號的成骨分化相關病理的治療提供了潛在基礎。研究成果發表于Cell Communication and Signaling期刊題為“Endothelial-mesenchymal crosstalk drives osteogenic differentiation of human osteoblasts through Notch signaling"。

首先，為了研究 EC 和 OB 之間的細胞間相互作用對成骨分化的影響，使用直接和間接共培養模型（圖1 A）。結果表明，與 OB 單一培養相比，間接共培養抑制了成骨分化，而直接接觸增加了基質鈣化（圖1 B-C）。使用 RT-PCR  在早期階段觀察到，不同的共培養條件下 OB 中相似的成骨標志物表達，除了 COL1A1 在 OB 直接共培養時有差異（圖1 D）。因此，實驗發現，根據細胞之間是否存在直接接觸，EC 可以對 OB 成骨分化同時具有骨誘導和骨抑制作用。

圖1     EC 和 OB 的共培養條件會影響成骨分化。

進一步分析 OB 和 EC 在不同共培養條件下的蛋白質組學和轉錄組學譜（圖2 A）。在 OB 的生物信息學分析過程中，鑒定了 22351 個轉錄本和 2966 個蛋白質；EC鑒定了 22539 個轉錄本和 3073 個蛋白質（圖2 B、C）。主成分分析（PCA）表明，根據轉錄組學和蛋白質組學數據，OB 在直接、間接和對照條件下形成混合簇（圖2 D）。這表明，當 OB 和 EC 共培養時，OB 譜保持相當穩定。與成骨細胞不同，EC 在與 OB 共培養的不同條件下表現出不同的蛋白質組學和轉錄組學特征（圖2 E），表明 EC 對與 OB 共培養的各種條件有顯著的反應。

差異表達分析顯示，當 OB 直接共培養時，成骨標志物和 Notch 信號通路成分的表達增加。基因本體論（GO）分析突出了與細胞外基質重組和細胞運動相關的激活過程，而激酶活性、MAPK 信號和細胞增殖等過程受到抑制。通路分析確定了細胞因子-細胞因子受體和 Notch 信號通路的激活，以及 Rap1 和 Wnt 信號的抑制。當 OB 間接共培養時，發現與細胞周期、p53 和 FoxO 通路相關的轉錄本下調。

當 EC 間接共培養時，在上調元件中，BMP 信號轉導抑制劑、SMAD 蛋白、TGF-β 配體和 IHNBA 最為突出。Jak/STAT 通路成分在蛋白質組學和轉錄組學數據中也顯著上調。此外，對內皮功能很重要的關鍵因子，包括一氧化氮合酶1（NOS1）、NOS3 和 KLF4 表達均有所增加。進一步分析確定了 TGF-β 和細胞因子-細胞因子受體相互作用通路的參與，而下調的轉錄本與細胞粘附和 Ras/PI3K-Akt 信號有關，這在蛋白質組學數據中也觀察到。

當 EC直接共培養時，同樣觀察到參與 BMP 信號和 Jak/STAT 信號的的成分表達增加。與 EC 間接共培養不同的是，在 EC 直接共培養中觀察到 PI3K-Akt 信號通路轉錄本的上調。然而，直接共培養過程中較顯著的轉錄組變化與骨骼發育過程有關，涉及 RUNX2、ALPL、LOX、WNT5A、WNT5B 和骨組織膠原蛋白等關鍵樞紐基因。在這些信號通路中，Notch 通路成為主要參與者。已知該通路可促進內皮-間充質轉化，與在直接共培養中觀察到的 SNAI2、TWIST1 和 ACTA2 激活一致。實驗已經確定，只有直接共培養會導致 Notch 信號成分的表達水平增加，當使用間接培養方法培養 OB 和 EC 時，在 Notch 受體和配體的表達中沒有觀察到這種增加。

這些數據表明，OB 在與 EC 的不同共培養條件下表現出相似的蛋白質組學和轉錄組學特征，而 EC 表現出不同的分子特征，表明它們對不同的共培養條件有顯著的反應。與 OB 的間接共培養刺激了 EC 中 BMP 信號通路的多種抑制劑的產生，這是已知成骨分化的關鍵驅動因素。同時，EC 和 OB 之間的直接細胞間接觸可激活 Notch 信號通路。這種 Notch 介導的信號轉導反過來又誘導了 EC 群體中與成骨分化相關的基因的表達。

圖2    OB 和 EC 在不同共培養條件下的蛋白質轉錄組學分析。

接下來，為了找出 EC 中 Notch 信號通路各種成分活性的降低如何影響直接共培養中 OB 的成骨分化，在共培養前用一種攜帶靶向 Notch 通路基因的 shRNA 慢病毒轉導 EC（圖3 A、B）。根據染色結果，發現 EC 中 Notch 信號通路的某些組分（NOTCH1、NOTCH3、NOTCH4 和 MAML1）的敲低在共培養時對 OB 的成骨轉化具有抑制作用。此外，NOTCH1 和 NOTCH3 的敲低顯示出較強的影響。下一步繼續研究了 EC 中 Notch1 或 Notch3 的胞內結構域對 Notch 的激活如何影響直接共培養過程中 OB 的成骨分化（圖3 C）。OB 與過表達 Notch1（NICD1）和 Notch3（NICD3）細胞內結構域的 EC 共培養導致鈣化水平增加。茜素紅染色強度的定量分析證實，相對于對照共培養，OB 的成骨分化程度在統計學上顯著增加或減少（圖3 D）。這說明，OB 的成骨分化可以在細胞間直接接觸期間通過調節 EC 中的 Notch 信號來控制。

圖3    誘導成骨分化 14 天后，完整原代 OB 和轉導的 EC 直接共培養的茜素紅染色。

最后，為了闡明由 Notch 信號通路的失活/激活導致的 EC 的哪些變化會影響 OB 的成骨分化，實驗鑒定了用慢病毒構建體（激活 NICD1 和 NICD3 或抑制 NOTCH1 和 NOTCH3）修飾的 EC 的轉錄組譜（圖4 A）。差異表達基因（DEG）分析表明，與失活的 Notch 樣本相比，Notch 結構域激活的樣本中檢測到的 DEG 分別高出 1.5-1.7 倍。這一趨勢表明，Notch 胞內結構域的激活比敲低 Notch 受體對整體基因表達譜變化的貢獻更大。由 shNOTCH1 或 shNOTCH3 轉導的 EC 形成混合簇，而過表達 NICD1 和 NICD3 的 EC 在 PCA 上也彼此靠近聚集，但沒有重疊（圖4 B）。

在每組中顯示特定改變的前幾個差異表達基因（圖4 C）。過表達 NICD1 和 NICD3 的 EC 顯示 ANGPTL2、PLVAP、LAMB3、SLCA4、MEST、SEMA5A、GUCY1A1、SLC46A3、SFRP1、SULF1、OFLML2A、ITGA11、LINC01614、COL8A 和 SDC2 的表達增加。對于敲低 NOTCH1 和 NOTCH3 的 EC，DYSF、MMP10、PTGS1、SGK1、APLN、ANXA3、PLAT、MT2A、EDN1 和 CD247 基因的表達增加。還發現 EC 中 NICD1 和 NICD3 的過表達以及 NOTCH1 和 NOTCH3 的敲低均顯著降低 ENSG00000284946、SPAG5、HMGB2、PLK1 和 PRC1 的表達。

此外，實驗選擇了一組在兩個方向上都顯示出對 Notch 信號調節的反應性轉錄譜的基因，確定在 NICD1 和 NICD3 激活的 EC 中，轉錄本 GJA5、SULF1、SDC1、DLL4、TMTC1、CRYAB、PTHLH 和 PCDH7 上調。相反，在 NOTCH1 和 NOTCH3 敲低的 EC 中，這些相同轉錄本的表達降低（圖4 D）。

對 DEGs 進行功能注釋，結果表明，NICD1 和 NICD3 過表達導致 EC 中表達水平升高的 DEGs 與細胞外結構、細胞外基質組織以及骨化相關的基因表達有關。同時，通過分析鑒定的代謝通路與 TGF-β 信號和 PI3K-AKT 信號通路有關。對于 EC 中 NOTCH1 和 NOTCH3 的敲低，觀察到與染色體分離、DNA 復制和細胞周期相關的過程下調。

圖4    Notch 激活/失活期間 EC 的轉錄組學特征。

圖5    圖形概要

總之，該研究發現內皮細胞對成骨分化過程具有雙重影響。抑制成骨特性與內皮細胞分泌的旁分泌因子的作用有關。而內皮細胞的誘導成骨特性是由 Notch 信號通路介導的，并且只有在與間充質細胞（這里指成骨細胞）物理接觸的情況下才能實現。研究確定了內皮細胞中 Notch1 和 Notch3 的失活抑制了成骨細胞的成骨分化，而激活內皮細胞中 Notch1 和 Notch3 提高了內皮-成骨細胞共培養物的成骨分化程度。因此，內皮細胞 Notch 通路的修飾可能是增強/抑制成骨細胞成骨分化的工具。

參考文獻：Perepletchikova D, Kuchur P, Basovich L, Khvorova I, Lobov A, Azarkina K, Aksenov N, Bozhkova S, Karelkin V, Malashicheva A. Endothelial-mesenchymal crosstalk drives osteogenic differentiation of human osteoblasts through Notch signaling. Cell Commun Signal. 2025 Feb 19;23(1):100. doi: 10.1186/s12964-025-02096-0. Erratum in: Cell Commun Signal. 2025 Mar 12;23(1):133. doi: 10.1186/s12964-025-02118-x. PMID: 39972367; PMCID: PMC11841332.

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