Vascular Semaphorin 7A upregulation by disturbed flow promotes atherosclerosis through endothelial β1 integrin

Keywords: Atherogenesis, Endothelial phenotypic changes, Disturbed blood flow, Leukocyte recruitment, Semaphorin 7A.

內(nèi)皮細(xì)胞能感知并響應(yīng)各類(lèi)病理生理刺激，以此維持血管的完整性與穩(wěn)態(tài)。當(dāng)暴露于受擾血流時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)發(fā)生顯著表型變化，進(jìn)而導(dǎo)致血管通透性增加、細(xì)胞因子釋放及白細(xì)胞黏附，這類(lèi)血管壁的結(jié)構(gòu)和功能改變會(huì)提高動(dòng)脈粥樣硬化的易感性。以往研究已發(fā)現(xiàn)膜受體、黏附分子等一系列血流應(yīng)答相關(guān)分子，它們被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的潛在治療靶點(diǎn)。

軸突導(dǎo)向因子（Semaphorins）最初被認(rèn)定為神經(jīng)元生長(zhǎng)的調(diào)控因子，其家族部分成員還參與免疫應(yīng)答、血管發(fā)育等生理及病理過(guò)程。其中，Sema7A是 GPI 錨定的細(xì)胞表面蛋白，具有特定結(jié)構(gòu)域，在神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)，可調(diào)控炎癥應(yīng)答、癌癥進(jìn)展等，且在缺氧等誘導(dǎo)的急性炎癥中，肺內(nèi)皮細(xì)胞的 Sema7A 會(huì)被 HIF-1α 上調(diào)，但目前尚無(wú)其參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的相關(guān)報(bào)道。研究團(tuán)隊(duì)此前發(fā)現(xiàn)，敲除軸突導(dǎo)向因子家族成員 Sema4D 可抑制動(dòng)脈粥樣硬化。

因此，蘇州大學(xué)唐仲英血液學(xué)研究中心的研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)高脂飲食喂養(yǎng)的 ApoE?/?小鼠頸動(dòng)脈部分結(jié)扎模型來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)受擾血流會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中 Sema7A 的表達(dá)上調(diào)，而基因敲除 Sema7A 能減輕 ApoE?/?小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化。研究成果發(fā)表在Arterioscler Thromb Vasc Biol期刊，題為“Vascular Semaphorin 7A upregulation by disturbed flow promotes atherosclerosis through endothelial β1 integrin"。

首先，為了探究 Sema7A 在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用，研究人員通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)的 Sema7A?/?ApoE?/?小鼠模型發(fā)現(xiàn)，Sema7A 基因敲除可使小鼠主動(dòng)脈的粥樣硬化病變面積減少 51.5%（主動(dòng)脈弓減少zui顯著）（圖 1A、B），主動(dòng)脈根部脂質(zhì)蓄積面積減少 51.8%（圖 1C、D），且小鼠的血清脂質(zhì)和體重未受影響。同時(shí)，人類(lèi)動(dòng)脈粥樣硬化頸動(dòng)脈組織中 Sema7A 蛋白水平顯著高于健康腹主動(dòng)脈 （圖 1E）。這些結(jié)果表明 Sema7A 參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。

圖1   Sema7A 缺失減少 ApoE?/?小鼠主動(dòng)脈脂質(zhì)沉積且血管 Sema7A 在動(dòng)脈粥樣硬化中上調(diào)。

通過(guò)對(duì)比不同血管區(qū)域發(fā)現(xiàn)，易受紊亂血流影響的主動(dòng)脈弓及主動(dòng)脈小彎側(cè)，其 Sema7A 的 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均高于血流較穩(wěn)定的區(qū)域（圖 2A-C）。在體內(nèi)通過(guò)部分頸動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)紊亂血流后，結(jié)扎側(cè)頸總動(dòng)脈的 Sema7A mRNA 水平顯著升高（圖 2F），且內(nèi)皮細(xì)胞中 Sema7A 蛋白表達(dá)明顯增加（圖 2G）。體外實(shí)驗(yàn)中，暴露于振蕩剪切應(yīng)力的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，其 Sema7A mRNA 水平也高于層流剪切應(yīng)力處理的細(xì)胞（圖 2H）。這些結(jié)果共同證實(shí)了紊亂血流對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞 Sema7A 表達(dá)的上調(diào)作用。

為了進(jìn)一步探究紊亂血流如何上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中 Sema7A 的表達(dá)， 研究人員通過(guò)計(jì)算機(jī)啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)，人和小鼠的 Sema7A 啟動(dòng)子區(qū)域存在剪切應(yīng)力響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子 CREB 的潛在結(jié)合位點(diǎn)。鑒于 PKA 是 CREB 在血流信號(hào)中的經(jīng)典上游調(diào)控因子，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，用 H89 抑制 PKA 后，CREB 磷酸化水平降低，而 Sema7A 的 mRNA 和蛋白表達(dá)增加（圖 2I-L）。這表明 PKA/CREB 信號(hào)通路的抑制可能是紊亂血流上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞 Sema7A 表達(dá)的潛在機(jī)制。

圖2    紊亂血流上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中 Sema7A 的表達(dá)。

隨后，為了明確紊亂血流誘導(dǎo)的 Sema7A 表達(dá)是否參與內(nèi)皮炎癥，研究人員檢測(cè)了部分頸動(dòng)脈結(jié)扎（PCL）術(shù)后 Sema7A+/+ 小鼠和 Sema7A?/?小鼠頸動(dòng)脈中 ICAM-1 和 VCAM-1 的水平。結(jié)果顯示，紊亂血流會(huì)上調(diào)內(nèi)皮黏附分子 ICAM-1 和 VCAM-1 的表達(dá)，而 Sema7A 缺失可消除這種上調(diào) —Sema7A?/?小鼠經(jīng) PCL 處理的左頸總動(dòng)脈中，ICAM-1 和 VCAM-1 的 mRNA 水平及蛋白表達(dá)均低于 Sema7A+/+ 小鼠（圖 3A-F）。同時(shí)，Sema7A 缺失還會(huì)降低 P - 選擇素的 mRNA 水平，但對(duì) E - 選擇素?zé)o顯著影響，表明其對(duì)黏附分子的調(diào)控具有選擇性。這些結(jié)果表明，Sema7A 缺失可減少紊亂血流誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞 ICAM-1、VCAM-1 等黏附分子的表達(dá)。

研究人員進(jìn)一步探究了 Sema7A 在動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)過(guò)程中的作用。結(jié)果顯示，Sema7A 缺失能顯著減少白細(xì)胞滾動(dòng)和黏附：在經(jīng) TNF-α 預(yù)處理的小鼠提睪肌小靜脈中，Sema7A?/?小鼠的白細(xì)胞滾動(dòng)和黏附分別減少 45.2% 和 68.2%（圖 3G、H ）。在改良的 PCL 模型中，其頸動(dòng)脈內(nèi)皮上的白細(xì)胞黏附減少 67.2%（圖 3I、J）。這表明，Sema7A 缺失可減少紊亂血流誘導(dǎo)的黏附分子上調(diào)，進(jìn)而減少小鼠體內(nèi)的白細(xì)胞黏附。 此外，在 PCL 模型中，與 Sema7A+/+ApoE?/?小鼠相比，Sema7A?/?ApoE?/?小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積顯著減?。p少約 66%）（圖 3K、L）。這些結(jié)果表明，Sema7A 可促進(jìn)紊亂血流誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。

圖3   Sema7A 缺失減少紊亂血流誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中 ICAM-1 和 VCAM-1 的表達(dá)、白細(xì)胞黏附及斑塊形成。

接著，為了研究 Sema7A 在動(dòng)脈粥樣硬化中調(diào)控 ICAM-1、VCAM-1 表達(dá)及白細(xì)胞黏附的機(jī)制，研究構(gòu)建了 Sema7A 過(guò)表達(dá)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系。檢測(cè)顯示，與轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)照病毒的細(xì)胞相比，Sema7A 過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中 ICAM-1 和 VCAM-1 的表達(dá)水平顯著升高（圖 4A-D）。研究人員還探究了 Sema7A 調(diào)控內(nèi)皮功能障礙的機(jī)制，發(fā)現(xiàn) β1 整合素是其關(guān)鍵受體。實(shí)驗(yàn)顯示，用抗體阻斷 β1 或 α1 整合素亞基，可降低過(guò)表達(dá) Sema7A 的 HUVECs 中 ICAM-1 的表達(dá)（圖 4E）。這表明，Sema7A 可能通過(guò) α1β1 異二聚體發(fā)揮作用。進(jìn)一步研究表明，Sema7A 過(guò)表達(dá)會(huì)激活 FAK（圖 4F），而抑制 FAK、MEK1/2 或 NFκB 相關(guān)酶（IKK-1/2）后，ICAM-1 的高表達(dá)及 NFκB P65 的磷酸化均受抑制（圖 4G、H） 。綜上，Sema7A 通過(guò) β1 整合素及其下游的 FAK/MEK1/2/NFκB 信號(hào)通路，介導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙。

為了探究 β1 整合素及下游 FAK/MEK1/2/NFκB 信號(hào)在單核細(xì)胞 - 內(nèi)皮細(xì)胞相互作用中的作用，研究人員開(kāi)展了體外單核細(xì)胞 - 內(nèi)皮細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)顯示：過(guò)表達(dá) Sema7A 的 HUVECs 對(duì) THP-1 細(xì)胞的黏附顯著增加（約為對(duì)照的 2.1 倍）。而阻斷 β1 或 α1 整合素，或抑制 FAK、MEK1/2、NFκB 后，這種增強(qiáng)的黏附作用被明顯減弱（圖 4I、J）。這表明 Sema7A 通過(guò) β1 整合素依賴的方式，并借助下游 FAK/MEK1/2/NFκB 信號(hào)通路，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)及單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用。

圖4   Sema7A 過(guò)表達(dá)增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)及單核細(xì)胞 - 內(nèi)皮相互作用。

接下來(lái)，為了明確血管源性與血源性 Sema7A 在白細(xì)胞黏附中的作用，研究人員進(jìn)行了體外白細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖 5A 所示：經(jīng) LPS 處理的 Sema7A?/?主動(dòng)脈內(nèi)皮與 Sema7A?/?白細(xì)胞共孵育時(shí)，單核細(xì)胞黏附略有減少；但當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞本身缺失 Sema7A（Sema7A?/?）時(shí)，無(wú)論與之共孵育的白細(xì)胞是否表達(dá) Sema7A，單核細(xì)胞黏附均幾乎wanquan阻斷。這一結(jié)果表明，在炎癥刺激下，血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的 Sema7A 是介導(dǎo)主動(dòng)脈單核細(xì)胞黏附的主要因素。

最后，為了明確血管源性與血源性 Sema7A 在紊亂血流誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化中的作用，研究構(gòu)建了骨髓移植嵌合小鼠模型，結(jié)果如圖 5B 所示：無(wú)論移植是Sema7A?/?ApoE?/?還是 Sema7A+/+ApoE?/?的血細(xì)胞，Sema7A?/?ApoE?/?小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化病變面積均顯著小于 Sema7A+/+ApoE?/?小鼠，尤其在受紊亂血流影響的主動(dòng)脈弓處更為明顯。這表明，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生中，內(nèi)皮細(xì)胞源性 Sema7A 起主要作用，而非血源性Sema7A。

圖5    內(nèi)皮細(xì)胞 Sema7A 對(duì)促進(jìn)白細(xì)胞黏附和斑塊形成起主要作用。

總之，該研究指出，Sema7A 在紊亂血流引發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞功能異常及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成中扮演關(guān)鍵角色。其促動(dòng)脈粥樣硬化作用主要通過(guò)整合素 β1 介導(dǎo)，該受體可激活下游 FAK/MAPK/NFκB 信號(hào)通路，進(jìn)而推動(dòng)白細(xì)胞黏附、浸潤(rùn)及動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。這些發(fā)現(xiàn)為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供了新的潛在靶點(diǎn)和策略。

參考文獻(xiàn)：Hu S, Liu Y, You T, Heath J, Xu L, Zheng X, Wang A, Wang Y, Li F, Yang F, Cao Y, Zhang H, van Gils JM, van Zonneveld AJ, Jo H, Wu Q, Zhang Y, Tang C, Zhu L. Vascular Semaphorin 7A Upregulation by Disturbed Flow Promotes Atherosclerosis Through Endothelial β1 Integrin. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2018 Feb;38(2):335-343. doi: 10.1161/ATVBAHA.117.310491. Epub 2017 Dec 21. PMID: 29269512; PMCID: PMC5785426.

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