Activating autophagy promotes skin regeneration induced by mechanical stretch during tissue expansion

Keywords: Autophagy, Mechanical stretch, Skin regeneration, Tissue expansion

組織擴張術(shù)是整形外科修復(fù)燒傷或創(chuàng)傷的重要手段，其通過機械牽張促使健康組織再生出類似正常的額外皮膚。然而，該技術(shù)存在擴張效率低、術(shù)后易因真皮過薄和血供差引發(fā)并發(fā)癥等問題，且其誘導(dǎo)皮膚再生的機制尚未被充分闡明，因此有必要深入探索相關(guān)機制并尋找潛在治療靶點。 

自噬作為一種維持細(xì)胞和組織穩(wěn)態(tài)、提升細(xì)胞存活率的細(xì)胞過程，參與細(xì)胞增殖、分化、血管生成等多種生物學(xué)過程，且在組織再生（如斑馬魚尾鰭、心臟再生）、傷口愈合及毛發(fā)再生中發(fā)揮作用，甚至可能與組織對機械牽張的響應(yīng)相關(guān)，例如在成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等中，機械牽張可誘導(dǎo)自噬以保護細(xì)胞或參與相關(guān)生理過程。但目前對于組織擴張過程中是否存在自噬誘導(dǎo)，以及自噬對機械牽張引發(fā)的皮膚再生有何影響，仍不明確。

研究團隊此前構(gòu)建了可靠的小鼠皮膚擴張模型，其擴張皮膚特征與人類相似，且在該模型的擴張皮膚組織中檢測到大量自噬體，提示機械牽張在組織擴張中可誘導(dǎo)自噬，這為后續(xù)探究自噬調(diào)控對組織擴張時皮膚再生的影響提供了基礎(chǔ)。 

基于此，為了明確自噬與皮膚再生的關(guān)系，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院整形外科的研究團隊采用大鼠頭皮擴張模型，在不同時間點收集擴張皮膚，并用雷帕霉素和 autophinib 調(diào)控自噬，通過多項指標(biāo)評估皮膚再生情況。研究成果發(fā)表在Burns  Trauma期刊，題為“Activating autophagy promotes skin regeneration induced by mechanical stretch during tissue expansion"。

首先，為了探究組織擴張過程中機械牽張是否會誘導(dǎo)自噬，研究人員建立了大鼠頭皮組織擴張模型（圖 1a）。結(jié)果顯示，擴張皮膚中 LC3-II 表達更高，在擴張的表皮和真皮中均觀察到大量點狀熒光（圖 1c），這表明組織擴張過程中機械牽張誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生。機械牽張刺激使 LC3-II、beclin1 表達增加、p62 表達降低（圖 1d），自噬流在擴張后 48 小時達最高。這些表明組織擴張中的機械牽張能以時間依賴的方式誘導(dǎo)自噬。 

圖1    皮膚組織擴張過程中機械牽張誘導(dǎo)自噬。 

接著，為探究自噬對組織擴張過程中皮膚再生的影響，研究人員通過對大鼠擴張頭皮分別用 DMSO（對照）、雷帕霉素（rapa）、雷帕霉素聯(lián)合自噬抑制劑 autophinib（rapa + autophinib） 及 autophinib 處理。通過測量標(biāo)記的擴張皮膚的面積和厚度，來評估皮膚再生效率（圖 2a）。結(jié)果顯示，雷帕霉素組的皮膚面積、表皮和真皮厚度均大于對照組，而 autophinib 組則相反，且該組一半皮膚出現(xiàn)壞死和結(jié)痂（圖 2b和c ）。同時，雷帕霉素組中自噬相關(guān)標(biāo)志物 LC3-II、beclin1 表達上調(diào)，p62 表達下調(diào)，autophinib 組則呈相反趨（圖 3a和b）。且 LC3-II 陽性 puncta 多在細(xì)胞增殖旺盛的表皮和毛囊。這表明組織擴張中皮膚再生與自噬活性密切相關(guān)，激活自噬可促進再生，抑制自噬則起抑制作用。   

 圖2   雷帕霉素促進組織擴張過程中的皮膚再生，而自噬抑制劑 autophinib 抑制皮膚再生。

 圖3   擴張皮膚中自噬流的檢測。 

為了評估組織擴張過程中自噬調(diào)控對細(xì)胞增殖和凋亡的影響，研究人員通過對擴張皮膚進行 PCNA 免疫組化染色、TUNEL 染色及凋亡相關(guān)蛋白檢測。結(jié)果顯示，雷帕霉素組 PCNA 陽性細(xì)胞數(shù)顯著多于對照組（圖 4a），autophinib 組最少。雷帕霉素組凋亡細(xì)胞比例zui低，autophinib 組最高（圖 4b），且雷帕霉素組凋亡抑制蛋白 BCL-2 表達升高，促凋亡蛋白 BAX 和切割型半胱天冬酶 3 表達降低（圖 4c）。這表明激活自噬可促進細(xì)胞增殖、減少凋亡，抑制自噬則效果相反。 

圖4     激活自噬可促進擴張皮膚中的細(xì)胞增殖并減少細(xì)胞凋亡。 

接下來，研究人員通過檢測干細(xì)胞標(biāo)志物，探究自噬對組織擴張中干細(xì)胞數(shù)量的影響。結(jié)果顯示，雷帕霉素組的表皮基底干細(xì)胞標(biāo)志物 CK14 和毛囊干細(xì)胞標(biāo)志物 CK15 表達均高于對照組及雷帕霉素 + autophinib 組，autophinib 組這兩種標(biāo)志物表達zui低。且雷帕霉素組成熟表皮細(xì)胞標(biāo)志物 CK10 表達極低（圖 5）。這表明激活自噬可增加組織擴張中擴張皮膚的表皮基底干細(xì)胞和毛囊干細(xì)胞數(shù)量，抑制自噬則會減少干細(xì)胞數(shù)量。 

 圖5   激活自噬可增加擴張皮膚中表皮基底干細(xì)胞和毛囊干細(xì)胞的數(shù)量。 

為了評估自噬激活或抑制時擴張皮膚的血液灌注情況 ，研究人員通過激光多普勒血流成像和 CD34 免疫組化染色。結(jié)果顯示，雷帕霉素組擴張皮膚的微循環(huán)血流灌注量顯著高于對照組和雷帕霉素 + autophinib 組，autophinib 組zui低（圖 6a）。同時，雷帕霉素組 CD34 陽性血管數(shù)量最多，autophinib 組最少（圖 6b）。這表明在組織擴張中，激活自噬可促進血管生成，抑制自噬則會阻礙血管生成。 

圖6    激活自噬可促進擴張皮膚中的血管生成。

隨后，研究人員通過 Masson 三色染色和蛋白質(zhì)印跡法，探究自噬對擴張皮膚膠原蛋白合成的影響。結(jié)果顯示，雷帕霉素組的膠原容積分?jǐn)?shù)最高，I 型和 III 型膠原蛋白表達顯著高于對照組。autophinib 組則膠原容積分?jǐn)?shù)zui低，兩種膠原蛋白表達也zui低（圖 7）。這表明在組織擴張中，激活自噬可促進膠原蛋白合成，抑制自噬則會減少膠原蛋白合成。

 圖7    激活自噬可增強擴張皮膚中的膠原蛋白合成。 

最后，研究人員通過蛋白質(zhì)印跡法檢測多種生長因子的表達，探究自噬對擴張皮膚中生長因子的影響。結(jié)果如圖 8 顯示，雷帕霉素處理的擴張皮膚中 bFGF、EGF、CTGF、TGF-β 和 VEGF 的表達顯著高于 DMSO 組和雷帕霉素 + autophinib 組，而 autophinib 處理組中這些生長因子的表達降低。這表明激活自噬可增加擴張皮膚中上述生長因子的水平。

 圖8    激活自噬可增加擴張皮膚中生長因子的表達。 

總之，該研究表明，組織擴張后 48 小時自噬流zui強，雷帕霉素激活自噬可增大擴張皮膚面積、增加表皮和真皮厚度，并通過促進細(xì)胞增殖、增多干細(xì)胞、減少凋亡、改善血管生成、促進膠原合成及生長因子分泌來加速皮膚再生，而阻斷自噬則會逆轉(zhuǎn)這些再生效果。調(diào)控自噬有望成為一項有效的治療手段，不僅能提升組織擴張的效率，還可降低皮膚壞死等并發(fā)癥的出現(xiàn)幾率。  

參考文獻：Du J, Liu W, Song Y, Zhang Y, Dong C, Xiong S, Huang Z, Wang T, Ding J, He Q, Yu Z, Ma X. Activating autophagy promotes skin regeneration induced by mechanical stretch during tissue expansion. Burns Trauma. 2024 Feb 7;12:tkad057. doi: 10.1093/burnst/tkad057. PMID: 38328438; PMCID: PMC10849167. 

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