High Shear Stress Reduces ERG Causing Endothelial-Mesenchymal Transition and Pulmonary Arterial Hypertension

Keywords: ERG; aorto-caval shunt mice; endothelial cells; endothelial-mesenchymal transition; pulmonary arterial hypertension; shear stress.

研究顯示，先天性心臟病（CHD）的外周肺動脈（PAs）中存在高剪應力（HSS；100 dyn/cm2），如室間隔缺損病伴肺動脈高壓（PAH）。在動物模型中，病理性HSS已被作為誘導PAH的因素進行了研究，然而，HSS 觸發和誘導肺血管變化進展的機制尚不清楚，最終導致肺血管阻力（PVR）和嚴重 PAH的不可逆上升。相對于靜態條件，當PA內皮細胞（PAECs）承受生理層流剪切應力（LSS；15 dyn/cm2）時，KLF 2/4 及其與 SWI/SNF染色質重塑因子的相互作用增加，這導致 NOS3（一氧化氮合酶3）、BMPR2（骨形態發生蛋白受體2）和 SMAD5（SMAD 家族成員5）等保護性基因的誘導，以及與血管收縮和平滑肌細胞增殖相關的基因的抑制，例如 EDN1（內皮素1）。

ERG（ETS轉錄因子家族）促進 KLF2與血栓調節蛋白啟動子結合，維持LSS下的抗凝作用。ERG 驅動 SMAD1，同時抑制 SMAD3 活性以防止內皮細胞間充質轉化 （EndMT）。ERG的缺失與 NF-κB（核因子-κB）活性和 EndMT 的抑制有關。在 PAH 患者肺組織 PAs 中也觀察到 ERG 降低，BMPR2 和 ERG 被認為是協同調節以維持 PAEC 穩態。PAH 患者存在 BMPR2 的突變和表達或功能降低并且還與 EndMT 相關聯。BMPR2缺失導致 EndMT 的機制與染色質重塑蛋白HMGA1（高遷移率蛋白A1）的增加有關。

基于此，在美國斯坦福心血管研究所、Betty Irene Moore 兒童心臟中心及日本名古屋市立大學醫學研究科新生兒兒科等團隊的一項研究中，將 PAEC 暴露于與動脈（直徑<500μm） PAH 相關的HSS ，然后確定了這種水平的HSS是否介導BMPR2的下降并誘導EndMT，所涉及的機制是否與KLF2/4的下降或ERG介導的基因調控有關，以及恢復下降的轉錄因子是否可以防止培養細胞中BMPR2的降低和隨后的EndMT。研究成果發表于 Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 期刊題為“High Shear Stress Reduces ERG Causing Endothelial-Mesenchymal Transition and Pulmonary Arterial Hypertension"。

首先，利用體外系統將 HSS（100 dyn/cm2；24h）與 LSS（15 dyn/cm2；24h）遞送給人 PAECs。結果發現，與 LSS 相比，僅 24 小時的 HSS 誘導 EndMT 特征，蛋白質免疫印跡評估顯示，轉錄因子SNAI1/2 和間充質標志物 ACTA2 增加，EC 表面標志物 PECAM1 和 CDH5 減少（圖1 A）。免疫熒光成像證實了這些發現，并通過另一種間充質標志物和 EndMT 標志物 FSP1（成纖維細胞特異性蛋白-1）的增加來擴展這些發現（圖1 B）。然后，試確定 HSS 介導的 EndMT 是否可能與 BMPR2 的減少有關，并且確實觀察到 HSS 介導的該受體的 mRNA 和蛋白質水平降低（圖1 C、D）。最近的研究表明，KLF2 的 N6-甲基腺苷修飾可能有助于 EndMT。然而，血流誘導的轉錄因子KLF2/4沒有被HSS改變（圖1 E、F）。這些數據表明，病理性HSS誘導EndMT。

然后，為了確定哪些轉錄因子結合位點可能會因 HSS 而失去活性，對 LSS、HSS 和靜態培養條件下的 PAEC 進行了 H3K27ac CUT&RUN。在全基因組范圍內，對H3K27ac活性降低的峰值進行基序富集分析，確定了來自SOX（SRY-box轉錄因子）和ETS（E-26）轉錄因子家族中的幾個候選基序，包括ERG，這是一種可以與KLF2和 SWI/SNF相互作用的先鋒因子。進一步測定表明，LSS下KLF4與ERG的相互作用在HSS下顯著減少。這表明，ERG 降低可能有助于 HSS 誘導的 EndMT。確實，HSS 顯著降低了 ERG mRNA 和蛋白質水平。此外，還通過共聚焦成像對移植時切除的 PAH 患者和未使用的供體肺作為對照的患者的人肺組織切片進行 ERG 核表達評估。與對照組 PAs 相比，IPAH 或伴有室間隔缺損的相關 PAH-CHD 患者的 PAs 核 ERG 表達顯著降低。這些數據表明，病理性HSS降低ERG表達。

圖1     高剪切應力（HSS）誘導內皮細胞向間質轉化（EndMT）。

接下來，為了確定ERG的減少是否足以誘導EndMT，用ERG siRNA轉染PAECs，將細胞暴露于LSS。蛋白質免疫印跡評估顯示，PECAM1和CDH5蛋白水平降低，ACTA2和SNAI1/2水平升高。mRNA水平反映PECAM1和CDH5的降低以及ACTA2的增加，但SNAI1或SNAI2沒有改變，這表明這些轉錄因子的mRNA升高可能是短暫的。共聚焦圖像顯示，PECAM1和CDH5降低，ACTA2增加。在LSS下，ERG siRNA也降低了BMPR2 mRNA和蛋白質水平。

上述研究表明，在 LSS 下降低 ERG 足以誘導 EndMT，因此隨后確定了在 HSS 下替換 ERG 是否會阻止 EndMT。轉染慢病毒載體的ERG在HSS下增加了ERG，并通過蛋白質免疫印跡檢測到PECAM1和CDH5的增加以及ACTA2和SNAI1/2的減少驗證了阻止EndMT（圖2 A）。通過共聚焦成像也觀察到這些發現（圖2 B）。HSS下的BMPR2基因和蛋白表達也通過轉染ERG增加（圖2 C、D）。ERG的表達降低了細胞的縱橫比，與內皮表型的恢復一致。這說明，在HSS下轉導 ERG 可防止 EndMT。

圖2    補充 ERG（ETS 家族轉錄因子）可防止高剪切應力（HSS）下的內皮細胞間質轉化 （EndMT）。

進一步地，研究人員將上述發現與小鼠動靜脈分流術產生的 HSS 聯系起來，并確定與肺血管變化相關的進行性 PAH 是否可能與 EndMT 相關及是否可能通過將 ERG 靶向肺 ECs 來抑制。利用帶有肽標簽 AAV2-ESGHGYF 的 AAV2 載體，選擇性靶向肺 ECs，在進行假手術或動靜脈分流術前1周注射用Erg或熒光素酶載體包裹的AAV2-ESGHGYF。結果表明，這種動靜脈分流術在放置長達 8 周進行評估時會導致小鼠進行性 PAH。此外，假手術小鼠的腹部超聲成像顯示，下腔靜脈呈均勻顏色（紅色或藍色）信號，表明層流，而動靜脈分流的小鼠在擴大的下腔靜脈中顯示馬賽克顏色圖案，表明腹主動脈的血流受到干擾。這說明，動靜脈分流術引起的病理性HSS會誘發PAH。

磁共振成像確定，與動靜脈分流術一致，與假手術相比，兩個心室和下腔靜脈的尺寸均有所增加，Erg載體的構建對這一特征沒有影響。動靜脈分流術后 8 周，下腔靜脈 CO（圖3 A）和Po2（圖3 B）的升高也不受 Erg 載體的影響。所有組的主動脈收縮壓相似（圖3 C）。

心導管檢查顯示，假手術小鼠的RVSP（右心室收縮壓）在AAV-Erg處理前后無明顯差異。通過RVSP升高判斷，動靜脈分流術小鼠與假手術小鼠相比，顯示 PAH（37.2±1.0 vs 21.9±0.6 mm Hg）與先前在該模型中8周的發現一致。AAV-Erg 處理 導致RVSP變化降低50% 至29.2±0.8（圖3 D）。與假手術AAV-Erg小鼠相比，AAV-Erg動靜脈分流組的LVEDP（左心室舒張末壓）升高，但與用AAV-Con載體處理的動靜脈分流小鼠相比，LVEDP沒有升高（圖3 E）。此外，與AAV-Con載體相比，用AAV-Erg處理的動靜脈分流小鼠的PVR降低（圖3 F）。

圖3    通過補充肺動脈內皮細胞（PAEC） ERG （ETS家族轉錄因子）可減輕小鼠主動脈腔靜脈（AV）分流誘導的肺動脈高壓（PAH）。

最后，為了確定補充ERG對驅動EC表型變化的機械生物學刺激的影響，模擬每組小鼠PA樹中的WSS（壁剪應力）。在比較PA樹的各級時，WSS在所有組中隨血管尺寸減小而增加（圖3 G）。在PA分級的1至5級，對應直徑<100µm的血管，與AAV-Con載體治療的假手術組相比，AAV-Con載體治療的動靜脈分流術的WSS顯著增加。與AAV-Con載體相比，用AAV-Erg處理的動靜脈分流小鼠中PA 1至3級的WSS值較低，盡管它們仍然高于假手術小鼠（圖3 G）。在PA 4至5級中，用AAV-Erg處理的動靜脈分流小鼠的WSS值與對照組沒有區別。

與RVSP的增加一致，動靜脈分流的小鼠顯示出RV重量與體重的增加，而AAV-Erg治療的小鼠則減少（圖4 A）。與假手術小鼠相比，動靜脈分流小鼠的LV+S/體重比值同樣增加。因此，用AAV-Con處理的動靜脈分流動物的RV/LV + S重量比（右心室/左心室+室間隔）升高，但在給予AAV-Erg的動靜脈分流小鼠中沒有升高（圖4 A）。在用AAV-Con或AAV-Erg處理的假手術小鼠中，RV或LV + S/體重比或RV / LV + S的重量比沒有差異。

正如RVSP升高所預期的那樣，通過ACTA2染色判斷，具有動靜脈分流的小鼠在肺泡管和壁水平的遠端PAs肌肉化增加（圖4 B、C），以及通過tdTomato（標記EC）和ACTA2染色陽性的細胞來判斷EndMT的特征。與AAV-Con載體相比，AAV-Erg處理動靜脈分流小鼠的遠端動脈的肌肉化和EndMT均減少（圖4 D、E）。用 AAV-Erg 載體處理的小鼠的假手術肺中，蛋白質免疫印跡預計 ERG 和 CDH5 會增加。此外，在用AAV-Con載體治療的動靜脈分流小鼠中觀察到的ERG、CDH5和BMPR2的減少通過AAV-Erg載體治療消除，其值與用AAV-Con載體治療的假手術小鼠中觀察到的值相似（圖4 F）。這些數據表明，在動靜脈分流小鼠中補充PAEC ERG可防止EndMT并減輕PAH。

圖4     小鼠主動脈腔靜脈（AV）分流可誘導遠端肺動脈（PAs）的內皮-間充質轉化（EndMT）和重塑，這是通過肺動脈內皮細胞（PAECs）中Erg （ETS家族轉錄因子）的過度表達來挽救的。

圖5    圖形概要

HSS 導致 EndMT 的分子和形態學特征，包括內皮標志物的丟失以及 BMPR2 的丟失和平滑肌細胞標志物的增加。研究將這與ERG的缺失聯系起來，方法是在LSS下減少ERG并重現EndMT，或在HSS下補充ERG并逆轉EndMT；然后在帶有動靜脈分流的小鼠中概括了 EndMT 和進行性 PAH，并表明可以通過使用選擇性靶向肺 ECs 的載體補充 ERG 來減輕這種反應。總之，這項研究揭示，病理HSS降低肺EC ERG，導致EndMT和PAH。上調 ERG 的藥物可以逆轉 HSS 介導的 PAH 和由高血流量或狹窄的 PA 引起的閉塞性血管重塑。

參考文獻：Shinohara T, Moonen JR, Chun YH, Lee-Yow YC, Okamura K, Szafron JM, Kaplan J, Cao A, Wang L, Guntur D, Taylor S, Isobe S, Dong M, Yang W, Guo K, Franco BD, Pacharinsak C, Pisani LJ, Saitoh S, Mitani Y, Marsden AL, Engreitz JM, K?rbelin J, Rabinovitch M. High Shear Stress Reduces ERG Causing Endothelial-Mesenchymal Transition and Pulmonary Arterial Hypertension. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2025 Feb;45(2):218-237. doi: 10.1161/ATVBAHA.124.321092. Epub 2024 Dec 26. PMID: 39723537; PMCID: PMC11753934.

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