桂枝探針法PCR鑒定試劑盒（不含內參）

Ramulus cinnamomi(Cinnamomum cassia)Probe qPCR Kit (without internal control)

桂枝探針法PCR鑒定試劑盒（不含內參）產品及特點：
該試劑盒利用 PCR 技術的高度特異性和熒光探針的高靈敏度來實現對桂枝 DNA 的檢測。其特異性引物和熒光探針是根據桂枝基因組 DNA 中特定的保守序列設計的。在 PCR 反應過程中，引物會特異性地結合到桂枝 DNA 的目標區域，Taq DNA 聚合酶以 DNA 為模板，利用反應體系中的 dNTPs 進行 DNA 鏈的延伸合成，從而實現目標 DNA 片段的指數級擴增。同時，熒光探針與擴增出的目標 DNA 序列特異性雜交，Taq 酶的 5'-3' 外切酶活性會切割探針，使熒光基團與淬滅基團分離，釋放出熒光信號。通過實時監測熒光信號的變化，就可以判斷樣品中是否存在桂枝源性成分。它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物和探針經過優化，分析靈敏性高，可以達到 100 拷貝/反應。

3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據桂枝DNA 高度保守區設計，不會跟其他的 DNA 發生交叉反應。

5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量時其線性范圍不少于 5 個數量級。

6. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。

7. 本產品只能用于科研。

規格及成分：

運輸及保存：低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
自備試劑 樣品 DNA。

桂枝探針法PCR鑒定試劑盒（不含內參）使用方法：
一、稀釋標準曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 6 號管中加入 5μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 5 號管中加入 5μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 4 號管中加入 5μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7. 如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 上步所得 4 號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的起始體積一樣，以此作為

PC。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數樣品 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。

三、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個

用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（直接用第 6 步第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 PCR：

四、數據處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須沒有數值，或者 Ct 值等于或者大于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于 40。對待測樣品，如果其 Ct 小于 40 則為陽性。如果沒有 Ct 值，或大于或等于 40 則為陰性。
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