和光純藥時報 Vol.94 Number.1（2026年1月）， 地方獨立行政法人大阪府立醫院機構 大阪羽曳野醫療中心 新一代創藥創生中心 松山晃文著

1. 前言

在日本《再生醫學安全法》的監管下，目前已有因接受再生醫療而引發敗血癥的案例。這可能是由于未進行適當的樣品保存，且沒有做好無菌控制導致的。因此，本文將重點討論如何在藥物注射給患者之前，通過快速無菌試驗來確保患者安全。首先，確保無菌性的關鍵在于微生物檢測，我們將根據原理對其進行分類，并比較各種（微生物）檢測法的特點以及檢測范圍。然后，將討論快速無菌檢測法的選擇思路，最后闡述細胞加工制品的快速無菌檢測中未解決的技術難題。

2. 微生物檢測法的分類與應用

細菌檢測法可分為直接依賴細胞增殖活性的增殖依賴性檢測法，和非增殖依賴性檢測法。由于非增殖依賴性檢測法可以快速獲取檢測結果，常被用作快速無菌檢測。根據檢測原理，可將其進一步分為直接檢測內源性熒光物質的方法，以及添加熒光物質（或可被微生物轉化為熒光物質的基質）的方法。

增殖依賴性檢測法是檢測增殖過程中產生的二氧化碳、乙酸和乙醇等小分子化合物之類的化學副產物的方法。

非增殖依賴性檢測法包括拉曼光譜法、檢測菌體表面散射光的米氏散射法、特異性檢測微生物DNA的核酸檢測法，以及檢測微生物特異性內源性非熒光物質的方法。

表1《微生物檢測方法分類》從微生物檢測方法和原理出發，整理了各類增殖依賴性和非增殖依賴性的微生物檢測法 。

表1.微生物檢測法的分類

3. 快速無菌檢測法的現狀

3.1 核酸擴增法

該方法的原理是以細菌的基因序列為標靶，進行核酸擴增并檢測。通常是檢測細菌DNA中細菌的的16S或23S rRNA的DNA序列（即核酸rDNA序列）。據稱，每個細菌約有100個rDNA拷貝，與比其他微生物檢測法相比，該方法在靈敏度、速度以及操作簡易度上都更優異。然而，死菌rDNA的混入會導致假陽性問題。由于RNA易分解，過去一直認為rRNA檢測難以應用，但目前已有市售的可檢測rRNA的無菌檢測產品（即RiboNAT™）。該產品降低了死菌rDNA導致的假陽性，操作簡單的同時，還能確保檢測靈敏度和特異性。

3.2 流式細胞術（FCM）

該方法的原理是，對液體中懸浮的活菌染色，并在液相中檢測。由于該方法直接對細菌數進行計數，無需微生物增殖，因此能實現快速檢測。目前常規FCM法的檢測靈敏度約為100~1,000 cfu/mL，所以若不是培養后的樣品則難以用于無菌檢測。如果能開發出靈敏度小于1 cfu/mL的FCM法/技術，則其在再生醫療領域的應用未來可期。目前大多數FCM設備的檢測閾值都是0.5 μm，無法檢測如銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等小細菌（直徑約0.35 μm）。此外，還需注意細菌染色劑的非特異性問題。

3.3 生物發光法和熒光法

該方法不受抗生素影響，適用于全菌種，但會因為細胞等雜質干擾而導致假陽性。檢測只需數秒至數分鐘，因其主要用于檢測于氣體中的活菌，所以被廣泛用于無菌操作室的實時監測，目前市面上還有能檢測細菌的同時鑒定菌種的儀器。環境中的細菌受低溫、營養匱乏或藥物影響，大部分處于VBNC狀態（viable but non-culturable，可存活但非可培養狀態）。事實上，它的細菌檢出數量往往比使用培養基的空氣采樣法更高。由于VBNC細菌也呈陽性，所以與培養基法的結果缺乏一致性。

3.4 固相細胞計數法（SPC）

該方法的原理是使用過濾器捕獲液體中混雜的細菌，并通過活菌染色實現可視化計數。因無需培養，數小時即可獲得結果，這對于無法滅菌后出廠的再生醫療制品具有重要的應用價值。該方法還可以排除增殖抑制物質的干擾，可以實現菌數測定和無菌測試的快速檢測，兼具定量與定性分析能力。然而，要注意過濾器可能會堵塞，以及大部分細菌染色劑對細胞/細胞外囊泡有染色性。

3.5 氣體測定法

該方法的原理是通過檢測活菌培養時排放的CO₂等氣體的增加速率，實現細菌增殖的檢測。由于檢測需 3 天以上，因此作為快速檢測法的適用性受限。盡管操作流程簡單，但當預計樣品中存在抗生物質時，推薦使用含抗生素吸附磁珠的反應瓶。

3.6 薄膜過濾法（微菌落）

樣品過濾后，將濾膜放入培養基專用培養盒，培養后進行染色和檢測。該方法最初為制藥用水的無菌檢測而設計，因此僅適用于需氧培養。將該無菌檢測法應用于再生醫療領域的無菌檢測時表現出高靈敏度，檢測值≤10 cfu/100mL。

3.7 阻抗法

通過檢測細菌增殖過程中的阻抗（電阻）變化，檢測存活且可培養的微生物。由于阻抗隨樣品組成而異，需提前繪制各個樣品的標準曲線。在用于菌數檢測（定量）用時，由于需制備標準曲線，操作較為繁瑣。

3.8 脂肪酸分析法

從培養后的菌落中提取脂質，并使用GC-MS進行檢測，將檢測結果與數據庫進行比對以鑒定菌種。該方法的前處理步驟非常繁瑣，且所需受試菌量的樣本量達mg級，因此無法有效用于菌落計數和無菌檢測。

3.9 紅外吸收光譜測定法

以培養后的菌落作為受試樣品，使用異物分析用傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）進行非破壞性檢測。但目前尚無用于細菌快速檢測的市售儀器。

3.10 免疫學檢測法

該方法基于熒光檢測，可實現快速檢測，盡管可忽略雜質的干擾，但從定量定性的角度出發，無法應用于菌落計數及無菌檢測。但是，該方法非常適用于從復雜菌群中檢測出特定菌種。

3.11 質譜法

本方法以培養后的菌落為受試樣品，可快速完成檢測。使用胰蛋白酶處理菌落后，采用TOF-MS進行蛋白質譜分析，再通過數據庫比對鑒定菌落的菌種。該方法操作簡便，且成本較低，但檢測儀器價格高昂。所以該方法難以用于無菌檢測，也基本無法實現細菌計數；但是若用于菌種鑒定，其可靠性較高。

4. 關于快速無菌檢測法的選擇

適當的無菌檢測法取決于無菌檢測的樣本種類，例如細胞種類、細胞懸液和細胞清洗液，因此檢測前需進行討論（表2）。例如， 富血小板血漿（PRP）不僅含有血小板，還含有大量中性粒細胞。即使將細菌輸入PRP，受中性粒細胞的吞噬作用影響，菌落形成單位（CFU）也會隨時間逐漸下降。此外，由于 PRP 未經培養等處理，細菌污染與增殖風險較低，尤其使用經認證的醫療設備采集的 PRP或許不需要無菌檢測。另一方面，有報告顯示，第三類再生醫療等提供計劃的血液來源細胞及第二類（自體）間充質干細胞，存在因特定細胞制品引發敗血癥的病例，因此不僅需在前期討論（在日本需經認證再生醫療等委員會的審查）階段進行充分評估，還必須在細胞制品輸注前確認其無菌性。鑒于市面上已有符合技術標準的無菌檢測技術，可在輸注前提供無菌檢測結果，所以不進行無菌檢測的決定在倫理上缺乏合理性。

為快速、經濟、便捷地保障無菌性，選擇核酸擴增法（3.1）、FCM（3.2）、生物發光法和熒光法（3.3）、固相細胞計數法（3.4）中的任意一種，或是組合上述的方法是較為現實地選擇。FCM與生物發光法和熒光法面臨的問題在于如何實現目標和非目標細胞（未來還將包括細胞外囊泡）與細菌的有效分離；核酸擴增法則存在死菌rDNA等的非特異性擴增問題。一般來說，檢測的快速性與靈敏度、特異性之間往往需要權衡，而通過組合上述技術原理，有望將快速性與靈敏度、特異性同步提升至良好水平。

此外，給藥路徑和給藥部位的選擇也非常重要，尤其是向中樞神經系統或與其相連的視網膜給藥時確保無菌性非常關鍵。筆者期望認證再生醫療委員會能針對此問題進行深入探討。

5. 快速無菌檢測法使用中相關的技術問題

參考藥品GMP標準，需要抽取成品的10%~30%開展質量檢測，并依據藥典方法確保其無菌性。盡管細胞制品難以遵循GMP要求，但在未能確保無菌性的情況下進行給藥是違背倫理且無法接受的。因此，采用符合藥典同等要求的無菌性的快速無菌檢測法已獲得認可。在歐洲藥典中，由于自體來源細胞制品的珍貴性，業界也在探索對最終培養廢液以及細胞清洗廢液進行無菌測試。然而，這通常需要對數十毫升甚至升（L）級別的廢液樣本進行檢測，而前文所述的各種快速檢測法往往僅適用于數百微升至 1 毫升左右的微量樣本, 這是目前的局限所在。未來，亟待開發能夠實現大體積樣本濃縮，以及從樣本中高效富集回收細菌性微生物的相關技術。

6. 結語

上述各類微生物檢測法的選擇，需要根據生產或出貨管理的目的而定。核酸擴增法以及生物發光法和熒光法（包括FCM）發展迅速，若能與相關設備同步開發并完成方法驗證，這種方法會成為與固相細胞計數法以及氣體檢測法相媲美的快速微生物檢測技術。應用合適的快速無菌檢測法，將為再生醫療提供強有力的安全保障。我們期望，只有經無菌性驗證的細胞制品方能 應用于臨床患者。

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